专利名称：一种利用微载体技术灌注培养细胞生产重组蛋白的方法
技术领域：
本发明属于生物制药工艺领域。具体涉及一种利用微载体技术灌注培养动物细胞生产蛋白的方法。
背景技术：
重组蛋白质类药物作为治疗性药物越来越凸显其重要的医用价值和商业价值。一般情况下，较大的、结构较复杂的蛋白质都是采用哺乳动物细胞表达系统来进行生产的。因此，重组蛋白质类药物的高水平生产依赖于哺乳动物细胞的培养工艺的选择与优化。目前，动物细胞培养工艺繁多，归纳起来有三大类，即贴壁培养、悬浮培养和固定
化培养。贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行单层培养。由于细胞固定于表面，不需要复杂的细胞截流装置，便于采用灌注培养。然而与悬浮培养相比，贴壁培养扩大培养比较困难，不能有效监测。悬浮培养是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。悬浮培养系统主要由于非贴壁依赖性细胞培养，由于动物细胞对搅拌和通气造成的流体剪切很敏感，因此保护细胞免受剪切力伤害是放大培养中一个重要问题。固定化培养是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养的一种方法。可以说，不同的培养工艺各有其特点。细胞微载体贴附悬浮培养，是贴壁培养技术的一种。其原理是将对细胞无害的微载体颗粒加入到反应器内的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。微载体贴附悬浮培养兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，容易放大，是公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，尤其适合工业上有重要价值的贴壁依赖型细胞系，如BHK、CHO等细胞。然而，利用生物反应器系统进行微载体大规模细胞培养，存在诸多影响因素和限制。其主要限制因素包括细胞对剪切力的敏感性、氧的传递效率以及传代和扩大培养等。无论是悬浮培养还是贴壁培养，就操作方式而言，可以分为:分批培养(Batch)、连续培养(Continuous)、灌注培养(Perfusion)、以及流加培养(Fed-batch)等，不同操作方式有其不同的特点。分批培养(Batch)，一次补料一次收获，操作简便，由于营养成分缺乏和代谢废物的积累，培养时间较短。流加培养(Fed-batch)，连续补料一次收获，适时补充营养成分，但是代谢废物积累过多。灌注培养(Perfusion)是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。其优点是可降低代谢废物，细胞密度较高从而较大提高产品的产量。针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，充分利用摇动式反应器传质、传氧效率高、营养物质混合均匀等优点，在此反应器中添加一定量微载体，为贴壁细胞生长提供表面积和微环境，并根据动物细胞生长代谢的特点，采用了优化的灌注培养方式，实现了贴壁细胞的高密度，长时间培养的，从而提高重组蛋白产量。
发明内容
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案实现:该种利用微载体技术灌注培养细胞生产重组蛋白的方法，主要包括细胞的接种，起始生长阶段，改变培养条件，后续生长阶段，并在整个周期监测培养条件，即细胞代谢、生长速率、产物合成平衡调控分析主要过程。具体步骤如下:
1、细胞的接种。接种的动物细胞应是含有编码重组蛋白质基因及遗传控制元件的载体重组宿主细胞，并且是经过使用常规蛋白质检测方法检测，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、斑点印迹(Dot blot)、高效液相色谱(HPLC)、亲和层析等，并确定具有高效表达的重组宿主细胞。在此所说的哺乳动物细胞包括杂交瘤细胞、重组CHO细胞等半贴壁、贴壁依赖性工程细胞。表达目的重组蛋白质的宿主细胞得到鉴定后，通过多种方法增殖细胞。复苏的细胞在有限传代次数下，一般经过容积递增的容器逐级扩增，可以使细胞扩增至任何所需细胞密度，再接种至下一中间反应器或者最终生产反应器，接种前细胞应处于一定活率范围之内。并且扩增过程中可辅以使用额外装置、培养物中添加额外化学物质等手段调控某些条件，包括但不局限于pH、温度、溶解氧等，创造利于细胞增殖的环境。生产用生物反应器的起始细胞接种密度可根据实际情况选定，起始细胞密度可以为约每毫升4X 104个至每毫升5X 107个活细胞，甚至更高。接种的细胞也可以稀释至所需的密度以接种于生产用生物反应器，稀释所用溶液可以为与生产所用 的相同培养基，也可以为其他培养基。接种的细胞可以通过低速离心等方法将细胞从上清液中分离出来，或者接种的细胞连同之使用的培养基一并接入至最终生产用反应器。此接入方法也可以用于将复苏的细胞经过容积递增逐级扩增至中间反应器。最终生产用反应器为摇动式反应器，如激流式细胞生物反应器，也可以是其他由外在机械带动引起反应器内细胞培养物流动的反应器，其混合方式为摇动式混合，微载体悬浮存在于反应器中，并处于不间断的流动状态，细胞可长时间、高密度生长于微载体表面，并可持续收获重组蛋白。反应器内部的微载体为大孔的纸片式微载体，其材质是一次性聚酯纤维纸片或其它可具有相同功能的材质，其为大小0.5-3.5cm2，形状呈“V”或“W”型折叠，优化的大小及密度利于悬浮，微载体的数量与反应器工作体积的关系为:重量(克)/反应器工作体积(升)=10-20/1。接种的细胞处于均匀的单细胞悬液状态。接入最终生产用反应器时，早期应该处于静止培养，或者低速温和的搅拌，或者间断地搅拌，同时使微载体和细胞处于小的体积培养，搅拌速度38-41rpm/分钟或者根据反应器的体积大小逐渐提升。不论采用何种方式，时间为6-24小时。细胞接种时的体积，可以开始时低于最终工作体积，例如约三分之一终体积，待细胞粘附于微载体上，立即或几天逐渐扩大培养体积至最终工作体积。2、有血清培养液起始生长阶段。如上所述，细胞接入生产用反应器后，一旦已经迁移入微载体内部，或者已贴附在载体表面之上，细胞将在有利于存活和生长的条件下进入起始生长阶段。具体的条件将取决于细胞的类型、接种的细胞数量，表达重组蛋白质的性质和特征，以及生产反应器的工作体积和微载体的数量。根据本发明，生产生物反应器可以是激流式细胞生物反应器，也可以是其他由外在机械带动引起反应器内细胞培养物流动的反应器。细胞的起始生长开始阶段，其培养体积可以是最终工作体积的几分之一，也可以是最终工作体积，如果培养体积从开始未达到最终工作体积，可以根据实际情况另补入培养基。起始生长阶段的搅拌速度的选择，原则上应当使微载体处于悬浮状态，在通过间隔搅拌或者静止粘附时期之后，应当连续搅拌，搅拌速度为38-56转/分钟。根据细胞密度，微载体沉降，及随之引起的气体交换、营养物质交换的要求，搅拌速度可以是恒定的或者变化的，通常是增加的。起始生长阶段细胞培养物温度的选择，主要基于细胞可保持存活、生长和微载体贴附的温度范围内。一般而言，细胞保持在37°C生长良好，但是也能够根据细胞的需求和生产要求，选择细胞生长的合适温度。在一些优选方案中，起始生长阶段的培养温度维持在单一、恒定的温度。在另一些方案中，起始生长阶段的培养温度维持在一系列温度范围内，在多个时间点不连续的提高或者降低温度。起始生长阶段的其他培养条件，如pH、溶解氧等等，是已知对该细胞最佳的，一般的pH为6.9-7.4、溶解氧为30%-80%，培养时间是3_10天。3、改变培养条件
适合细胞培养物最初生长的条件，不一定适合细胞对重组蛋白质的表达。根据本发明，在有血清培养液起始生长阶段的终末期，至少可以改变一个培养条件，以使细胞培养物发生代谢转变，由以生长代谢为主转为以产物合成为主。通过改变细 胞培养物的条件，包括但不局限于温度、化学诱导物、重量摩尔渗透压浓度、PH而完成的代谢转变，其特征在于提供细胞生存、生长的次优条件，抑制细胞增殖，使细胞培养物生长停滞或者变缓，大部分细胞由再增殖而转为生产蛋白，从而提高重组蛋白
质的产量。在本发明中，采用的是添加正丁酸钠使细胞培养物完成上述代谢转变。丁酸钠作为化学添加物，维持在整个细胞培养物的生产期。其浓度的选择，主要是基于细胞培养物保持存活力且能够对重组蛋白质的表达有较高促进作用范围内。一般而言，丁酸钠的浓度越高对细胞培养物生长的抑制作用越强，过高的浓度则反而使重组蛋白质的表达受到抑制。优选细胞培养物在丁酸钠0.5毫摩/升至1.0毫摩/升范围内的条件下仍保持一定存活力，且能在重组蛋白质表达上满足商业要求。4、无血清培养基后续生产阶段
一旦根据上述改变细胞培养条件，细胞培养物将进入后续生产阶段，后续生产阶段培养条件将有利于细胞的存活，并且适合重组蛋白质的表达以满足商业需求。后续生产阶段采用连续灌注培养法，即在细胞生长和重组蛋白质形成过程中，不断将部分条件培养基取出，同时又连续不断灌入新的培养基，每天的灌注体积可以是生产反应器工作体积的50%-300%，以达到提供营养物质，降低代谢废物的目的。根据本发明，收集培养物之前，细胞可以维持在后续生产阶段持续至达到重组蛋白单位体积收获量减低到最大单位体积收获量的1/2-1/4，或者葡萄糖每天的消耗量为最大消耗量1/2-1/4。在本发明中，也可以使细胞维持在无血清培养液后续生产阶段至指定时间。例如，根据细胞在后续生产阶段的起始浓度，细胞生长状态，可以使后续生产阶段维持10天以上。本发明实施者能够根据重组蛋白质的生产需求和细胞本身需求选择后续生产阶段的长度。在无血清培养液后续生产阶段，使用的无血清培养基为商品化的无血清培养基，或者为针对特定 克隆株优化的无血清培养基，并且向商品化的无血清培养基中添加部分生长因子、抗氧化剂、水解化合物，对于细胞的培养或重组多肽或蛋白质表达及稳定，可能是有利的或者是必要的。例如，向细胞培养物中添加生长因子、维持因子、抗氧化剂、如谷胱甘肽、维生素C、维生素E等，是有利或必要的。这些额外添加的部分，可随同培养基连续不断灌入生产反应器内，其总量保持微量。在后续生产阶段可适当提高搅拌速度，提高搅拌速度至45-56转/分钟，以提高氧和营养物质的扩散。控制参数设定为温度35-37°C，pH为6.8-7.2、溶解氧为20%_70%。5、监测培养条件
在本发明中，周期性的监测生长细胞的具体条件，对于使细胞处于最佳的生长状态或者处于最佳表达状态，或者由生长阶段转为生产阶段是有利的或必要的。作为非限制性实例，使用本领域公知的技术，监测温度、pH、葡萄糖浓度、乳酸盐浓度、铵盐浓度、谷氨酰胺浓度、摩尔渗透压浓度、重组蛋白质浓度。本发明的优点在于，使用微载体培养动物细胞，并使之处于悬浮、不间断的流动状态，利用了悬浮培养高效传质、传氧的特性，从而突破了传统贴壁细胞扩大培养受限于上述两种因素的难点，并且使用连续灌注的培养方式，避免了细胞代谢废物的积累，达到细胞高密度、长时间生长的目的，并且重组蛋白的产量也得到了较高的提升。
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图1是6.5L激流式生物反应器灌注培养系统 图2是后续生产阶段产量阶段变化 图3是后续生产阶段葡萄糖浓度变化与灌注量关系
上面已概括的描述了本发明，通过以下实施例将会更容易理解本发明，这些实施例的目的是描述说明而非限制本发明。实施例:
本发明所使用的CHOKl (来自ATCC编号CRL-9618)是含有编码促红细胞生成素(EPO)蛋白质基因及遗传控制元件的载体重组宿主细胞，并且确定的具有高效表达的重组宿主细胞。一旦重组宿主细胞确定并进行原始细胞株保存后，可使用本发明技术路线进行表达促红细胞生成素(EPO)重组细胞的放大培养并收获目的蛋白。其步骤如下:
1、种子细胞的扩增
表达促红素(EPO)重组CHOKl细胞复苏，并经过T25方瓶、T75方瓶、T150方瓶、转瓶，逐级扩增，培养条件37°C、5%C02，所使用的培养基为DMEM/F12，根据需要添加10%胎牛血清，pH为7.2。待细胞在转瓶中长至80%左右，达到1-1.5X109个细胞数接种至生产用生物反应器。2、接种细胞
接种细胞所用的生产反应器为6.5L激流式细胞生物反应器(见图1)，约50g微载体经过处理，悬浮于其中。转瓶培养的细胞经消化呈单细胞悬液，连同使用过的培养基一并接入生产反应器中，接种后工作体积3.5L，接种密度为3 X 105个/mL，严格无菌操作以防污染。接种后，混匀细胞，早期处于低速温和搅拌，搅拌速度为41转/分，时间为24小时。3、细胞有血清培养基扩增阶段
扩增阶段所使用的培养基也是含10%胎牛血清的DMEM/F12，细胞保持在37°C条件下，pH为6.9-7.4、溶解氧为40%-60%，搅拌速度42-44转/分钟，培养时间是5_7天。4、改变培养条件
在有血清培养液起始生长阶段的终末期，改为无血清培养基表达，并添加正丁酸钠，以使细胞培养物发生代谢转变，由以生长代谢为主转为以产物合成为主。正丁酸钠浓度保持在1.0毫摩/升，维持在整个细胞培养物的生产期。5、无血清培养基后续生产阶段
使用添加正丁酸钠的无血清培养基，采用连续灌注培养法，每天的灌注体积是生产反应器工作体积的140%，后续生产阶段持续至营养物质的消耗下降至最大葡萄糖消耗的1/2。在无血清培养液后续生产阶段，使用的无血清培养基为商品化的无血清培养基，并且添加2%。水解化 合物。在此阶段，提高搅拌速度至45-48转/分。温度37°C，pH为6.9-7.0、溶解氧为60%。6、监测培养条件
在整个培养周期监测温度、pH、葡萄糖浓度、乳酸盐浓度、及不定期监测表达促红细胞生成素(EPO)浓度。结果概述:
整个培养周期为35天-37天，后续生产阶段30天，促红细胞生成素(EPO)收获量2025毫克，后续生产阶段产量阶段变化见图2。后续生产阶段葡萄糖浓度变化与灌注量关系见图3。
权利要求
1.一种利用微载体技术灌注培养细胞生产重组蛋白的方法，其特征在于，此生产方法用于细胞培养的反应器，其混合方式为摇动式混合，微载体悬浮存在于反应器中，并处于不间断的流动状态，细胞可长时间、高密度生长于微载体表面，并可持续收获重组蛋白。
2.权利要求1所述的混合方式所使用的反应器为摇动式的反应器，可以是激流式细胞生物反应器，也可以是其他由外在机械带动引起反应器内细胞培养物流动的反应器。
3.权利要求1所述的微载体为大孔的纸片式微载体，其材质可以是一次性聚酯纤维纸片或其它可具有相同功能的材质，其为大小0.5-3.5cm2，形状呈“V”或“W”型折叠，优化的大小及密度利于悬浮，微载体的数量与反应器工作体积的关系为:重量(克)/反应器工作体积(升)=10-20/1。
4.权利要求1所述的一种利用微载体技术灌注培养细胞生产重组蛋白的方法，其生产步骤如下所述: (1)重组细胞株的培养与扩增，达到起始细胞密度后，接种入含有一定量微载体生物反应器内； (2)经过静止过程，细胞进入有血清培养液起始生长阶段； (3)当细胞生长到一定密度的情况下，改变细胞培养条件，使细胞进入无血清培养液后续生产阶段，并持续收获含重组蛋白培养液并进行纯化分离； 同时在整个培养周期中，定期监测培养条件。
5.根据权利4所述的重组细胞株，其特征是，含有编码多肽或蛋白质基因及遗传控制元件的载体重组宿主细胞，包括CHO、SP20、NSO0
6.根据权利4所述起始细胞`接种密度，其特征是，起始细胞密度可以为约每毫升4X104个至每毫升5X 107个。
7.根据权利4所述接种后的静止过程，其特征是，接入反应器后，早期处于静止培养，或者低速温和的搅拌，或者间断温和的搅拌，同时使微载体和细胞处于小的体积培养，搅拌速度38-41转/分钟或者根据反应器的体积大小逐渐提升，时间为6-24小时。
8.根据权利4所述将重组细胞株接种入生物反应器这一步骤，其特征是，细胞接种时的体积，开始时低于最终工作体积，是能浸泡微载体及能使微载体均匀搅拌的最小体积。
9.根据权利4所述细胞进入有血清培养液起始生长阶段这一步骤，其特征是，在细胞起始生长开始阶段，其培养体积可以是最终工作体积的几分之一，也可以是最终工作体积，也可以补入培养基，一次性或逐步达到最终工作体积。
10.根据权利4所述的细胞进入有血清培养液起始生长阶段这一步骤，包括如下特征:反应器温度设置37°C，pH为6.9-7.4、溶解氧为30%_80%，搅拌速度为38-56转/分钟，培养时间是3-10天。
11.根据权利4所述的当细胞生长到一定密度的情况下，改变细胞培养条件，其中所述的改变细胞培养条件，选自温度、化学诱导物、重量摩尔渗透压浓度、pH、培养基，及其组合。
12.根据权利11所述的化学诱导物，其所指正丁酸钠，添加的正丁酸钠维持在整个细胞培养物的生产期，浓度在0.5毫摩/升至1.0毫摩/升范围内。
13.根据权利4所述使细胞进入无血清培养液后续生产阶段，其特征是，后续生产阶段采用连续灌注培养法，每天的灌注体积可以是生产反应器工作体积的50%-300%。
14.根据权利4所述使细胞进入无血清培养液后续生产阶段，其特征是，后续生产阶段持续至达到重组蛋白单位体积收获量减低到最大单位体积收获量的1/2-1/4，或者葡萄糖每天的消耗量为最大消耗量1/2-1/4，时间上后续生产阶段维持10天以上。
15.根据权利4所述使细胞进入无血清培养液后续生产阶段，其特征是，提高搅拌速度至 45-56 转 / 分，温度 35-37°C, pH 为 6.8-7.2、溶解氧为 20%_70%。
16.根据权利4所述使细胞进入无血清培养液后续生产阶段，其特征是，使用的无血清培养基为商品化的无血清培养基，或者为针对特定克隆株优化的无血清培养基，或者商品化的无血清培养基中添加部分生长因子、抗氧化剂、水解化合物，部分得到优化的培养基。
17.根据权利4所述在整个培养周期中，监测培养条件，其特征是，监测温度、pH、葡萄糖浓度、乳酸盐浓度、铵盐浓度、谷氨酰胺浓度、摩尔渗透压浓度、重组蛋白质浓度。
18.根据权利要求1、4所述的方法，用于细胞株的重组蛋白的生产，包括抗体及其衍生物，如嵌合型抗 体和人源化抗体，融合蛋白等。
全文摘要
本发明公开了一种动物细胞大规模、高密度、微载体技术灌注培养细胞生产重组蛋白的方法。其特点是利用摇动式反应器，微载体悬浮于反应器中，并处于不间断的流动状态，采用连续灌注的方式，不断补充营养物质并排出代谢废物，同时收获重组蛋白的方法。
文档编号C12R1/91GK103103237SQ20111035128
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者孟庆勇, 张秀芹, 张雪亭, 刘铁成, 王延涛, 李会成, 吕中华, 王莹, 李郑武, 黄宇红, 王丽娜 申请人:哈药集团技术中心