专利名称：一种β-葡聚糖酶的产生菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种e -葡聚糖酶的产生菌。
技术背景e-葡聚糖酶(e-glucanase)是一种结构性非淀粉多糖(NSP)是自然合成的多聚糖含量最多的糖类。由右旋葡萄糖(D型)以混合的e- (1， 3)， e- (1， 4)糖苷键随机排列的线性连接而成的葡萄糖聚合物。谷物类中所含有的卩-葡聚糖有独特的分子结构，赋予 了其独特的性质以高分子量的形式溶于水，且形成溶液的黏度很高给工业生产带来了诸 多的不便。如高分子量的大麦P-葡聚糖可引起麦汁和啤酒粘度增加，致使麦汁过滤困难， 得率降低，影响啤酒的稳定性和质量；以大麦等谷物做能量饲料，(3-葡聚糖能引起畜禽胃 液黏度增加，阻碍单胃动物对养份的吸收，谷物的词价值降低。然而啤酒的制备工艺及饲 料生产过程中添加P-葡聚糖酶，利用P-葡聚糖酶分解P-葡聚糖，就能够有效的改善p-葡 聚糖所带来的负面影响。因此，近年来对p-葡聚糖酶的研究受到广泛的重视并取得了一定 的进展，P-葡聚糖酶来源广泛，其中以细菌为主要酶源，在真菌，放线菌，藻类，软体动 物和高等植物中也存在。1942年，Hrmova等首次从燕麦中分离得到e-葡聚糖。20世纪90年代中期，M. Hahn 和T. Keite通过质谱结合X-射线结晶体学的方法对e-葡聚糖酶进行了大量研究，其结果表明e-葡聚糖酶为一反向平行的e-折叠体系，每出现一处折叠就剧增大量的蛋白质。0-葡聚糖酶也可由微生物产生，如细菌(芽孢杆菌)、真菌(曲霉、毛霉等)和瘤胃微生物等。微生物产e-葡聚糖酶系对e-葡聚糖多无特异性，只分解由e-i，2-， e-i，3-, e-1,4-和0-1,6-键构成的纤维素及昆布聚搪等。这些产酶菌广泛存在于青霉属、木霉属、曲霉属、镰刀菌属、毛霉属和纤维素诺卡氏菌属中，如娄地青霉和木素木霉等。而能特异分解e-葡聚糖的酶主要来源于芽孢杆菌属和曲霉属，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、浸麻芽孢杆菌(Bacillus macerans),解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulars)、地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、臭 曲霉(Aspergillusfoetidus)、冻土毛霉(Mucor hiemalis)禾口米曲霉(Aspergillus oryzae)，溶黄质厄氏菌(Qerskoviaxanthineolytica)。
0 -葡聚糖酶最早应用于啤酒工业，国外一些酶制剂公司如丹麦Novo公司、荷兰Gist 公司和美国Miles公司都推出自己的产品，这些产品有的是单纯含e-葡聚糖酶制剂，也 有的产品是混合酶性质，如含有a-淀粉酶、0-淀粉酶和朊酶等等。我国在八十年代初， 啤酒工业的糖化和酿造工艺中添加外源e —葡聚糖酶也逐^ 为啤酒生产厂家所重视并且应用在啤酒的制备工艺中。e-葡聚糖酶的生产及研究，被列入"六五"和"七五"攻关 项目的子专题，在获得工业化生产菌后，又列入国家"火炬计划"。p-葡聚糖酶是重要的工业用酶，可有效消除谷物p-葡聚糖在酿造和饲料工业中产生的负面影响，但热稳定性和酶活力普遍较低已成为影响(3-葡聚糖酶应用效果的重要因素。发明内容本发明的目的是提供一种能有效的解决现阶段p-葡聚糖酶工业用酶热稳定性差的问 题，耐热性能良好的e-葡聚糖酶的产生菌。本发明的e-葡聚糖酶的产生菌分类命名为枯草芽孢杆菌(fi"C!7/M S"&船)，其保藏登记号为CGMCC No.2077，保藏日期为2007年6月8日，保藏单位中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。其16SrRNA基因见基因序列表。 制备方法1、 菌株的分离采集小麦田中的土样直接涂布初筛培养基平板50°C培养3-5天,观察透明圈生长情况， 选出H/C比值较大的菌株(H/C为透明圈直径H和菌落直径C之比)，分离得纯培养，得到 产耐热P -葡聚糖酶菌株W-9 (自命名)。2、 菌株的发酵将种子培养液倒入装有250ml发酵培养基的三角瓶中，置于回转式恒温调速摇瓶柜中 进行好氧发酵，转速为200转/分，37'C发酵2天，发酵液离心，上清液即为e-葡聚糖酶 酶液，置于4'C保存。本发明的e -葡聚糖酶的产生菌所产e -葡聚糖酶酶液的最适pH6.o左右，最适温度为70°C，在温度50。C-70'C的范围内，酶活性变化不大，经60'C下处理30min后，其酶活性 没有明显变化；经60'C保温1小时，剩余酶活为70%，经6(TC保温5小时，剩余酶活为 20%，可以在酿酒工艺中所要求的温度6(TC下更好的发挥作用。该酶的耐酸性能良好，在 pH 5.0-6.5之间均有较高酶活，在pH6.0范围内处理lh后酶活性维持在70%以上。这使得 该酶可以在饲料工艺中更好的应用。所以该菌株W—9具有较好的耐热性能和研究价值。
图l是本发明的菌株W9电镜照片(X15000)图；图2是本发明的0 -葡聚糖酶粗酶的标准曲线图； 图3是本发明的0 -葡聚糖酶粗酶的pH曲线图；图4是本发明的e -葡聚糖酶粗酶的温度曲线图；图5是本发明的0 -葡聚糖酶粗酶的pH耐受性曲线图；图6是本发明的e -葡聚糖酶粗酶的温度耐受性曲线图；本发明的微生物保藏日期为2007年6月8日，保藏单位简称CGMCC，保藏编号 CGMCC No. 2077。
具体实施方式
实施例1、 从(安宁)小麦土壤中分离得到菌株W9，直接涂布初筛培养基平板50'C培养3-5 天，观察透明圈生长情况，选出H/C比值较大的菌株(H/C为透明圈直径H和菌落直径C 之比)，分离得纯培养e-葡聚糖酶菌株W—9。所用筛选培养基0-葡聚糖2.5，刚果红 溶液8mL，琼脂2.0， PH自然。2、 菌株的鉴定根据形态特征、培养特征，生理生化测定，16S rDNA序列分析进行系统的分类研究。 菌株W-9为革兰氏阳性芽孢杆菌，具有中生芽孢。在LB琼脂平板上菌落白色，边缘波状，呈不规则形，表面具有皱褶，不透明。W9生长温度范围是40 6(TC，能水解淀粉、酪素、明胶，过氧化氢酶、卵磷脂酶、硝酸盐还原结果为阳性，形成吲哚、V.P实验、柠檬酸盐及丙酸盐利用、苯丙氨酸脱氨酶、酪氨酸分解结果为阴性。W-9和其参照菌株Bacillus subtilis中某些菌株的16S rRNA序列相似性为99%。所以结合Bacillus subtilis的菌落特征、生理生化特性，确定菌株W9为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)。菌株立体形态如图l所示。3. 菌株的发酵将种子培养液倒入装有250ml发酵培养基的三角瓶中，置于回转式恒温调速摇瓶柜中 进行好氧发酵，转速为200转/分，37'C发酵2天，发酵液离心，取上清液即为e-葡聚糖 酶酶液，置于4'C保存。所用发酵培养基燕麦1.5g，酵母膏0.5g， pH6.0，装液量20°/0。4. 酶活测定方法和粗酶酶学性质
4. 1原理在一定温度和PH条件下P -葡聚糖酶水解e -葡聚糖，产生的还原糖可将3， 5 — 二硝基水扬酸还原成橙色的氨基化合物，反应液颜色强度与酶活力大小成正比，而还 原糖的生成量又与待测酶液的酶活力大小成正比。通过测定反应液的吸光度，从而算出待测液的e-葡聚糖酶活力。4. 2试剂和溶液① 10. 0mg/mLr葡萄糖溶液取无水葡萄糖1. 000g加水溶解后定容至100mL。② 0. 05molA柠檬酸溶液盐酸性缓冲液0. 5mo1/1的拧檬酸溶液准确称取105. 0g 柠檬酸完全溶于800ml蒸馏水中，定容至1000ml，标记为A试液；0. 5mo1/1的柠檬酸三 钠溶液准确称取147.0g柠檬酸三钠完全溶于800ml蒸馏水中，定容至1000ml，标记为 B试液。③ 0. 5mo1/1的柠檬酸钠缓冲液取600ml的A试液与1000ml的B试液充分混匀， 标记为C试液。
0. 5mo1/1的拧檬酸盐酸性缓冲液取C试液1000ml加放到8000ml的蒸馏水中。 用PH计检测其ra值，必要时用3rao1/1的盐酸溶液或3mo1/1的氢氧化钠溶液调ffl值为 4.80，再定容至1000ml，混匀后标记为0. 05mol/l柠檬酸盐酸性缓冲液。同时标记PH为 4.80，配制日期在4。C冰箱内保存。⑤ i. o% e -葡聚糖底物精密称取e -葡聚糖i. ooog加入适量的乙醇再加入lOOtnlO. 05mol/l的酸性缓冲液中，加热溶解直至e—葡聚糖完全溶解，待乙醇完全蒸发出 后，用3mo1/1盐酸溶液或3mo1/1氢氧化钠溶液调PH值为4. 80，再用0. 05mol/l的酸性 缓冲液定容在100ml的容量瓶中。标记为1. 0% {3 -葡聚糖酸性溶液，同时标记PH为4. 80， 配制日期，并保存在4。C冰箱内。有效期为三天，使用前恢复到室温并摇匀。⑥ DNS试剂溶解10.0g 3，5-二硝基水扬酸，16. 0—氢氧化钠300. 0g酒石酸钾钠 于约700蒸馏水中，加热搅拌使完全溶解至澄清，放至常温并用蒸馏水定容至1000mL，置 于棕色试剂瓶中，暗处保存一个星期后使用。4. 3测定步骤①标准曲线的绘制取8支试管按下表加入试剂，稀释葡萄糖标准液，再加入3mlDNS 试剂，充分混匀置沸水中煮5min，水浴冷却后，用0号试管作对归在540nm下测其他试液 的吸光度。以吸光度为纵坐标，以葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。标准曲线如图2所 示。
试管号01234567缓冲液加入量(y l)500490480475470465460455葡萄糖标准液(ul)010202530354045葡萄量含量(！ig)0100200250300350400450② 待测酶液的制备(1) 液体酶用缓冲液稀释原酶液，使其吸光度(0D值)在0.20 — 0.25之间。(2) 固体酶精密称取固体原酶粉1.000g溶于80ml蒸馏水中(稀释倍数芸100倍 的直接用缓冲液溶解)，室温下磁力搅拌15min以上，用100ml容量瓶定容，离心后取清 液用缓冲液稀释，使其吸光度在0.20—0.25之间。③ 活力的测定(1) 取三支试管各加入0.5ml酸性(或中性)e—葡聚糖底物，与待测酶液一起在 5CTC水浴中预热5min。(2) 在第一，二支试管中加入0. 5ml待测酶液。40。C水浴中反应15min。(3) 在三支试管中各加入3ml的DNS试剂，然后在第三支试管中加入0. 5ml的待测酶液。(4) 摇匀三支试管后，在沸水浴中煮5min。(5) 水浴冷却至室温后，以第三支试管为对照在540nm条件下测第一，二支试管样 的吸光度。吸光度以在0.20—0.25之间为宜，若不在此范围内可改变稀释倍数重做。④酶活力的计算酶活力(IU/ml或IU/g):(葡萄糖等量值/180/10/0.5)*11 式中180指葡萄糖从微克量换算成微克分子数15指待测液与底物的反应时间0. 5指与底物反应的稀释倍数n指原酶液(或固体原酶)的稀释倍数 4. 4粗酶酶学性质① W-9菌株产e-葡聚糖酶的最适作用pH为6，如图3所示。② W-9菌株产e-葡聚糖酶的最适作用温度为7(TC，如图4所示。③ W-9菌株产P -葡聚糖酶有良好的pH耐受性，在pH 5.0-6.5之间均有较高酶活，在pH6.0范围内处理lh后酶活性维持在70%以上，如图5所示。
④在温度5(TC-7(TC的范围内，酶活性变化不大，经60。C下处理30min后，其酶活性 没有明显变化；经60。C保温1小时，剩余酶活为70%，经6(TC保温5小时，剩余酶活为 20%。如图6所示。
基因序列表该菌株的16SrRNA基因为1 GCTATACATG CAGTCGAGCG GACAGATGGG AGCTTGCTCC CTGATGTTAG CGGCGGACGG GTGAGTAACA 70CGTGGGTAAC CCGCATGGTT TGGTGAGGTA TGAGACACGG AGCMCGCCG TCGAATAGGG AATACGTAGG ATGTGAAAGC TGGAATTCCA GTCTGTAACT GTAMCGATG GCCTGGGGAG GTGGTTTAAT ACGTCCCCTT TMGTCCCGC CGGTGACAAA TGCTACMTG TCGGATCGCA TGAATACGTTCTGCCTGTM CMACATAM ACGGCTCACC CCCAGACTCC CGTGAGTGAT CGGTACCTTG TGGCMGCGT CCCCGGCTCA CGTGTAGCGG GACGCTGAGG AGTGCTMGT TACGGTCGCA TCGMGCMC CGGGGGCAGA MCGAGCGCA CCGGAGGMG GACAGMCM GTCTGCAACT CCCGGGCCTTGACTGGGATA AGGTGGCTTN AAGGCNACGA TACGGGAGGC GAAGGTTTTC ACGGTACCTA TGTCCGGMT ACCGGGGAGG TGAMTGCGT AGCGAAAGCG GTTAGGGGGT AGACTGAMC GCGMGAACCACTCCGGGAA GGCTACCACT TGCGTAGCCG AGCAGTAGGG GGATCGTAAA ACCAGAAAGC TATTGGGCGT GTCATTGGM AGAGATGTGG TGGGGAGCGA TTCCGCCCCT TCAMGGMT TTACCAGGTCACCGGGGCTA TACAGATGGA ACCTGAGAGG AATCTTCCGC GCTCTGTTGT CACGGCTAAC 雄GGGCTCG ACTGGGGMC AGGMCACCA ACAGGATTAG TAGTGCTGCA TGACGGGGGC TTGACATCCTATACCGGATG CCCGCGGCGC GTGATCGGCC AATGGACGAA TAGGGMGM TACGTGCCAG CAGGCGGTTT TTGAGTGCAG GTGGCGMGG ATACCCTGGT GCTAACGCAT CCGCACMGC CTGACAATCCGTGACAGGTG GTGCATGGTT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGAACCCTTGATC TTAGTTGCCA GCATTCAGTT GGGCACTCTAGTGGGGATGA CGTCAAATCA TCATGCCCCT TATGACCTGGAGGGCAGCGA MCCGCGAGG TTMGCCMT CCCACMATCCGACTGCGTG AAGCTGGMT CGCTAGTAAT CGCGGATCAGGTACACACCG CCCGTCACAC CACGAGAGTT TGTMCACCCGTTGTTTGM 141ATTAGCTAGT 211ACACTGGGAC 281AGTCTGACGG 351CMGTACCGT 421CAGCCGCGGT 491CTTMGTCTG 561AAGAGGAGAG 631CGACTCTCTG 701AGTCCACGCC 771TAAGCACTCC 841GGTGGAGCAT 911TAGAGATAGG 981GATGTTGGGT 1051AGGTGACTGC 1121GCTACACACG 1191TGTTCTCAGT 1261CATGCCGCGG 1331GAAGTCGGTG 1401AGGTMCCTT TTAGGAGCCA GCCGCCGMG GTGGGACAGA TGATTGGGGT GAAGTCGTAA CAAG
权利要求
1、一种β-葡聚糖酶的产生菌，其特征在于β-葡聚糖酶的产生菌分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏登记号为CGMCC No.2077。
全文摘要
本发明是一种β-葡聚糖酶的产生菌。β-葡聚糖酶的产生菌分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏登记号为CGMCC No.2077。本发明的β-葡聚糖酶的产生菌所产葡聚糖酶最适pH6.0左右，最适温度为70℃，在温度50℃-70℃的范围内，酶活性变化不大，经60℃保温5小时，剩余酶活为20％，具有较好的耐热性能和研究价值。
文档编号C12N1/20GK101157904SQ20071006621
公开日2008年4月9日 申请日期2007年9月21日 优先权日2007年9月21日
发明者王丽丽, 黄遵锡 申请人:云南师范大学