专利名称：：一种耐热植酸酶的产生菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及微生物
技术领域：
，具体地说是一种耐热植酸酶产生菌。技术背景植酸(phytate，Phyticacid,IP6)又名肌醇六磷酸酯(phosphoricacidesterofthecyclicalcoholinositol,myo-inositol-hexakisphosphate)，分子式C6H18024P5。植酸分子含有6个磷酸基团，是磷的重要贮藏形式，植物体内约60%80%的有机磷以植酸为载体存在。植酸不仅使磷不能被单胃动物利用，并且作为一种抗营养因子，植酸分子可迅速与二价、三价阳离子(如Ca2+、Mg2+、Fe3+、Zi^+等)及蛋白质结合形成不溶鳌合物，阻碍了单胃动物对其他矿质元素、蛋白质、淀粉、脂类、维生素等营养物质的消化、吸收和利用。为了解决单胃动物磷摄入量不足的问题，满足其对磷的需求，就必须在饲料中添加无机磷。但是，这样不仅提高了饲料的成本，而且饲料中未被分解的植酸磷随动物粪便排出体外。更严重的问题是大量的磷排入水中，作为水生植物最主要的限制性营养因子，刺激藻类及地面其他水生植物的生长，水体富营养化，随着过多水生植物的迅速生长、腐败，导致淡水水质恶化，水体溶氧量降低，危及鱼类和其他野生生物的生存植酸酶(phytase)是催化植酸水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称，包括植酸酶与酸性磷。植酸酶是一种新型酶制剂，主要作为饲料和食品的添加剂，应用前景十分广阔。在饲料工业中，磷是有机体的重要组成部分，作为一种必须的矿物元素在动物营养中具有重要作用，除了作为骨骼的成分外，也是机体内重要有机化合物及生物活性物质的元素来源。国内外大量实验证明，在单胃动物饲料中添加植酸酶能够提高磷的利用率，解除植酸的抗营养作用，提高矿物元素和蛋白质的吸收利用率，植酸酶在动物生长中的效果则主要表现在以下几方面增加血浆无机磷浓度及趾骨、胫骨灰分；同时对体重的增长也有一定效果。采用植酸酶代替无机磷还能使猪禽粪便中的含磷量减少25%65%。因此在饲料中添加植酸酶，不仅可以降低饲料的成本，而且可以降低排泄物中的磷含量，从而减少环境中的磷污染，有利于保护生态环境。在食品工业中，由于人类小肠中的植酸酶活性极低的特点，也导致了人类锌、铁、镁的缺乏和数量不平衡。目前，已有实验利用植酸酶处理大豆和面粉，以分解其中的植酸盐，提高植酸的降解率，消除植酸对矿物元素和蛋白质的鳌合作用，以提高粮食的利用率，提高粮食的营养和商品价值。植酸酶自1907年发现以来，微生物植酸酶的研究工作自20世纪60年代开始。工业生产植酸酶的微生物主要包括真菌中的黑曲霉(^5^^//船w扭r入根霉(朋/zo/附)和细菌中的大肠杆菌(Esc^n'cWaco//)和芽孢杆菌(WaccW7"s)。植酸酶于1993年在西欧实现商品化。欧共体推出了当前启用的3种植酸酶制剂荷兰Gise-Brocades公司推出了"自然磷"(Natuphos),其特点是对热稳定，且在碱性和酸性的条件下均具有活性；美国Allzeech公司推出的"澳吉美"植酸酶(Allxymephytase)，是一种黑曲霉发酵产物，其对热和pH稳定性较好；芬兰NovoNordisk公司推出了"NOVO"植酸酶，BASF公司生产的"酶他富"植酸酶等。目前，把植酸酶作为饲料添加剂已应用于实际生产，但仍然存在阻碍其广泛应用的技术难题。为防止沙门氏菌的污染，饲料加工过程中需要采用高温灭菌；同时颗粒饲料的制粒工艺也要经过一个短暂的高温(73°C95°C)过程，一般植酸酶的活性在此温度下不可避免地失活，因此耐热是植酸酶作为饲用添加剂应用的关键性问题。研究表明，随着制粒温度的升高(608(TC)其酶活力将随着下降(P〈0.01)。当6(TC时只有48°/。58%的酶活残留，而加热到80。C时仅有2%15%的残余酶活。因此耐热性是植酸酶在饲料工业应用中最主要的问题。迄今为止，国内外所报道的产耐酸耐热植酸酶的菌株主要为黑曲霉(^;pe^7/^m'g^)禾口芽抱杆菌(5accj7J"50。2005年KwanjiraChantasartrasamee等牛艮道的y^/erg/〃"51植酸酶最适温度为70°C，经8(TC处理2小时，剩余酶活为66%;2001年王娅茹等纯化得到的枯草芽孢杆菌中性植酸酶6(TC处理l小时活性减少90y。，6(TC处理2小时，活性全部丧失。
发明内容本发明的目的是提供一种能耐较高温度丧失活性较少的耐热植酸酶的产生菌。本发明是从腾冲温泉中分离得到一株产耐热植酸酶的菌株，菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其保藏编号为CGMCCNo.2076，保藏日期为2007年6月8日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。其所产酶最适pH为5.5，最适温度为6(TC左右，将该酶在7(TC分别保温60min，120min和180min，残余酶活性分别为70%，68%和63%;将该植酸酶在80。C分别保温60min，120min和180min，残余酶活性分别为43%，23%和15%;将该酶在90。C分别保温60min和120min，酶活损失明显，残余酶活性分别为21%，10%;说明该酶具有良好耐温性。该菌株的16SrRNA基因为〉TB-11CTGGCGGCGTGCCTMTACATGCMGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGA71CGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATMCTCCGGGAMCCGGGGCTAATACCGG141CGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGMTCTTCCGCMTGGAC351GMAGTCTGACGGAGCMCGCCGCGTGAGTGATGMGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGM421GGTMTACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGMTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGG561TTTCTTMGTCTGATGTGMAGCCCCCGGCTCMCCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGMCTTGAGTG631CAGMGAGGAGAGTGGMTTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGMCACCAGTGGCGA701AGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCT771AATTCGAAGCMCGCGMGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAA981TCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCG1051TGAGATGTTGGGTTMGTCCCGCMCGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTCCCAGCATTCAGTTGGGCACT1121CTAAGGTGACTGCCGGTGAC嵐CCGGAGGMGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACC1191TGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGMCAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTMGCCAATCCCACM1261ATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGMTCGCTAGTMTCGCGGAT1331CAGCATGCCGCGGTGMTACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTMCA1401CCCGAAGTCGGTGAGGTMCCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGMGGTGGGACAGATGATTGGGGTGMGTCG1471TAACMGGTAGCC本发明菌株的制备1、菌株的分离采集腾冲温泉的水样直接涂布初筛培养基平板5(TC培养3-5天，观察透明圈生长情况，选出H/C比值较大的菌株(H/C为透明圈直径H和菌落直径C之比)，挑选大而明显的透明圈的菌落划线分离纯化2-3次。纯化后将其菌株接入液体发酵培养基摇瓶发酵，37°C，200、转/分条件下发酵5天后，进一步复筛，最终分离筛选到产耐热植酸酶的菌株，命名为TB-1。2、菌株的初步鉴定根据《常见细菌系统鉴定手册》以及《一般细菌常用鉴定方法》对其进行形态特征、培养特征，生理生化测定等方面的初步鉴定。菌株TB-1为革兰氏阳性芽孢杆菌，具有中生芽孢。在LB琼脂平板上菌落米白色，边缘波状，呈不规则形，表面具有皱褶，不透明。TB-1好氧生长，生长温度范围是306(TC，5y。的NaCl、0.001%的溶菌酶中生长，能水解淀粉、酪素、明胶，过氧化氢酶、卵磷脂酶、硝酸盐还原结果为阳性，形成吲哚、V.P实验、柠檬酸盐及丙酸盐利用、苯丙氨酸脱氨酶、酪氨酸分解结果为阴性。该菌株初步鉴定为枯草芽孢杆菌(5aciW^s^tj7is)，其保藏登记号为CGMCCNo.2076。3、菌株的发酵将种子培养液倒入装有250ml发酵培养基的三角瓶中，置于回转式恒温调速摇瓶柜中进行好氧发酵，转速为200转/分，37。C发酵5天。发酵液离心，取上清液，即为粗酶酶液，置于4'C保存。本发明菌株所产植酸酶的最适pH5.5左右，当pH2.2时，酶液在室温放置2hr后，残余酶活力为47.7%;最适温度为6(TC，在温度55'C-65'C的范围内，酶活性变化不大，将该酶在7(TC分别保温60min，120min和180min，残余酶活性分别为70%，68°/。和63%;将该植酸酶在8(TC分别保温60min，120min和180min，残余酶活性分别为43%，23%和15%;将该酶在90。C分别保温60min和120min,酶活损失明显，残余酶活性分别为21%，10%;说明该酶具有良好耐温性。相比较而言，比已报道的枯草芽孢杆菌植酸酶有更好的耐热特性。本发明菌株既i满足饲料加工工业中高温灭菌的要求，同时又满足颗粒饲料的制粒工艺短暂的高温(73°C95°C)要求，本菌株所产耐热植酸酶可以作为饲料添加剂，应用于实际生产中具有优异的效果。图l为本发明的菌株TB-l电镜照片(X15000);图2为本发明的KAP04标准曲线图；图3为本发明的植酸酶反应的最适温度图；图4为本发明的温度对酶稳定性的影响图；图5为本发明的植酸酶反应的最适PH图；图6为本发明的pH对酶稳定性的影响图；具体实施方式实施例11、菌株的分离从中国云南腾冲温泉水样直接涂布初筛培养基平板5(TC培养3-5天，观察透明圈生长情况，选出H/C比值较大的菌株(H/C为透明圈直径H和菌落直径C之比)，选大而明显的透明圈的菌落划线分离纯化2-3次；纯化后将其菌株接入液体发酵培养基摇瓶发酵，37°C，200、转/分条件下发酵5天后，进一步复筛，最终分离筛选到产耐热植酸酶的菌株。所用培养基初筛培养基葡萄糖3.0g，NH萬0.5g，MgS040.003g，蒸馏水100ml，植酸钙0.5g，琼脂2g，pH5.5。液体摇瓶发酵培养基蛋白胨l.Og，米糠l.Og，蒸馏水100ml，pH5.5。2、菌株的鉴定根据形态特征、培养特征，生理生化测定，16SrRNA序列分析进行系统的分类研究。菌株TB-1为革兰氏阳性芽孢杆菌，具有中生芽孢。在LB琼脂平板上菌落米白色，边缘波状，呈不规则形，表面具有皱褶，不透明。TB-1好氧生长，生长温度范围是3060'C，5。/。的NaCl、0.001%的溶菌酶中生长，能水解淀粉、酪素、明胶，过氧化氢酶、卵磷脂酶、硝酸盐还原结果为阳性，形成吲哚、V.P实验、柠檬酸盐及丙酸盐利用、苯丙氨酸脱氨酶、酪氨酸分解结果为阴性。菌株的16SrRNA基因为〉TB-11CTGGCGGCGTGCCTMTACATGCMGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGA71CGGGTGAGTAACACGTGGGTMCCTGCCTGTMGACTGGGATMCTCCGGGAMCCGGGGCTAATACCGG141AGTTGGTGAGGTMCGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCG281GCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGMTCTTCCGCMTGGAC351G嵐GTCTGACGGAGCMCGCCGCGTGAGTGATGMGGTTTTCGGATCGT嵐GCTCTGTTGTTAGGGM421GGTMTACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGMTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGG561TTTCTTMGTCTGATGTGMAGCCCCCGGCTCMCCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGMCTTGAGTG631CAGAAGAGGAGAGTGGMTTCCACGTGTAGCGGTG嵐TGCGTAGAGATGTGGAGGMCACCAGTGGCGA701AGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAMGCGTGGGGAGCGMCAGGATTAGATACCCT771TCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCMGACTGAMCTCAAAGGMTTGACGGGGGCCCGCACA911AGCGGTGGAGCATGTGGTTTMTTCGAAGCMCGCGMGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACM981TCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCG1051TGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCMCGAGCGCMCCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACT1121CTMGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGMGGTGGGGATGACGTCMATCATCATGCCCCTTATGACC1191TGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGMC雄GGGCAGCGAMCCGCGAGGTTAAGCCMTCCCACAA1261ATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGMGCTGGMTCGCTAGTMTCGCGGAT1331CAGCATGCCGCGGTGMTACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTMCA1401CCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGMGGTGGGACAGATGATTGGGGTGMGTCG1471TAAC线GTAGCC3、菌株的发酵将种子培养液倒入装有250ml发酵培养基的三角瓶中，置于回转式恒温调速摇瓶柜中进行好氧发酵，转速为200转/分，37。C发酵5天；发酵液离心，取上清液，即为粗酶液，置于4。C保存。所用发酵培养基为麸皮4.0g，牛肉浸膏1.5g，吐温80400ppm，pH6.5。4、酶活测定方法和粗酶酶学性质(1)酶活测定方法采用GB/T18634-2002进行酶活性的测定。植酸酶活性单位定义为在PH5.5，6(TC条件下，每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放lumol的无机磷为一个酶活单位。i原理植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH4)3P04NH4V0316Mo03]复合物，在波长415nm下进行比色测定。ii试剂和溶液①乙酸缓冲液I:三水乙酸钠34.02g，吐温200.lg，蒸馏水1000ml，用盐酸调节pH至5.50士0.01，常温下存放2个月有效。②植酸钠溶液植酸钠(sigma)0.4950g，乙酸缓冲液I100ml;③硝酸溶液硝酸溶液100ml，蒸馏水200ml;钼酸铵溶液钼酸铵10.0g，氨水(25%)l.Oml，蒸馏水100ml;⑤饥酸铵溶液钒酸铵0.235g，硝酸溶液(D2ml，蒸馏水100ml，避光条件下保存一周有效；⑥颜色终止液硝酸溶液③钼酸铵溶液④钒酸铵溶液=2:1:1，混匀后使用，现用现配；⑦基准物磷酸二氢钾；m测定步骤①标准曲线准确称取0.6804g在105匸烘至恒重(2h)的基准物磷酸二氢钾于100ml容量瓶中，用乙酸缓冲液I溶解，并定容至100ml，浓度为50mmol/L，按表1稀释成不同比例浓度，以蒸馏水调零，在分光光度计415nm测定OD值。以无机磷浓度为横坐标，00415为纵坐标，列出直线回归方程(y=kx+b)。表1标准曲线浓度的配制<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>②反应顺序表2植酸酶活力测定步骤<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>依次加入待测反应液0.2ml0.2mlC最后"一步)6(TC反应30minV依次加入颜色终止液4ml4ml混合VV总体积10ml10ml③样品测定反应后的试样在室温下静止10min，如出现混浊，需在离心机上以10，000rpm/min离心10min，上清液以蒸馏水调零，在分光光度计415nm测定0D值。iv植酸酶活性单位定义为在pH5.5，60'C条件下，每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放lumol的无机磷为一个酶活单位。v酶活力的计算公式U=A0D415*n/k*t△0D415:实验组与对照组0D^之差；k:标准曲线k值；t:反应时间30min;m酶液稀释倍数。(2)粗酶酶学性质①反应的最适温度和温度对酶稳定性的影响如图3、4所示；②反应的最适pH和pH对酶稳定性的影响如图5、6所示；◎离子对酶活力的影响表3离子对酶活力的影响一相对酶活(％)一相对酶活(％)离子离子5ppm30ppm100卯m5ppm30ppmlOO卯m空白100.0100.0100.0p5+104.889.141.1Ca2+90.389.1101.4Cu2+35.578.180.0Mg2+101.6118.8108.282.294.075.3Mn2+103.287.593.2r90.360.939.8Fe2+112.990.288.0Zn2+93,579.786.权利要求1、一种耐热植酸酶的产生菌，菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其保藏编号为CGMCCNo.2076。2、根据权利要求l所述的植酸酶产生菌，其特征在于菌株的16SrRNA基因为〉TB-11CTGGCGGCGTGCCTMTACATGCMGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGA1CGGGTGAGTAACACGTGGGTMCCTGCCTGTMGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGG141AGTTGGTGAGGTMCGGCTCACCMGGCMCGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCG281GCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGMTCTTCCGCMTGGAC351GAMGTCTGACGGAGCMCGCCGCGTGAGTGATGMGGTTTTCGGATCGTAMGCTCTGTTGTTAGGGM421AGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGMACTGGGGAACTTGAGTG631CAGMGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGMATGCGTAG八GATGTGGAGGMCACCAGTGGCGA701AGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAMGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCT771TCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCMGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACA911AGCGGTGGAGCATGTGGTTTMTTCGMGCAACGCGMGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACM981TCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCG1051TGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCMCGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACT1121ACGTGCTACAATGGACAGMCMAGGGCAGCGAMCCGCGAGGTTAAGCCMTCCCACM1261ATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGMGCTGGMTCGCTAGTAATCGCGGAT1331CAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTMCA1401CCCGMGTCGGTGAGGTMCCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGMGGTGGGACAGATGATTGGGGTGMGTCG1471TMCMGGTAGCC。全文摘要本发明是一种耐热植酸酶的产生菌。菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其保藏编号为CGMCCNo.2076。本发明菌株所产植酸酶的最适pH5.5左右，当pH2.2时，酶液在室温放置2hr后，残余酶活力为47.7％；最适温度为60℃，在温度55℃-65℃的范围内，酶活性变化不大，将该酶在70℃分别保温60min，120min和180min，残余酶活性分别为70％，68％和63％；将该植酸酶在80℃分别保温60min，120min和180min，残余酶活性分别为43％，23％和15％；将该酶在90℃分别保温60min和120min，酶活损失明显，残余酶活性分别为21％，10％；说明该酶具有良好耐温性。本发明菌株既i满足饲料加工工业中高温灭菌的要求，同时又满足颗粒饲料的制粒工艺短暂的高温(73℃～95℃)要求，本菌株所产耐热植酸酶可以作为饲料添加剂，应用于实际生产中具有优异的效果。文档编号C12N15/31GK101113421SQ20071006598公开日2008年1月30日申请日期2007年6月22日优先权日2007年6月22日发明者唐湘华,萍桂,黄遵锡申请人:云南师范大学