专利名称：一种β-甘露聚糖酶的产生菌及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种0 -甘露聚糖酶的产生菌及其制备方法。
技术背景6-甘露聚糖酶(P-mannanase)又称e-1, 4-D-甘露聚糖酶(P_l， 4-D-mannan-mannanohydrolase， EC. 3. 2. 1. 78)，是一类能够水解含有P _1, 4_D-甘露糖 苷键的甘露寡糖、甘露多糖的内切酶，属于半纤维素酶类。并且是具有纤维素酶活性的广 谱诱导酶，广泛存在于自然界中，包括植物，如某些豆类植物(长豆角、瓜儿豆等)发芽 的种子中，以及天南星科植物魔芋萌发的球茎中；动物如海洋软体动物的肠道分泌液中都发现了e-甘露聚糖酶活性的存在。而微生物是e-甘露聚糖酶的主要来源，如细菌中的芽孢杆菌、假单孢菌、弧菌，真菌中的曲霉、梭孢菌以及放线菌[6]都有所报道。微生物来源 的0 -甘露聚糖酶具有活性高、成本低、提取方便以及比动植物更广的作用pH、温度范围 和底物专一性的显著特点，己在工业化生产和理化研究中得到了广泛的应用。P-甘露聚糖酶分解线状或分枝的甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖，生成甘露 寡糖(Mannose Oligosaccharide MOS)。甘露寡糖等功能性低聚糖具有低甜度、低热量、 稳定性好等特点，此外还可促进有益菌增殖、吸附病原菌、改善肠道微生态，提高机体免 疫力，甘露寡糖已经作为一种新型的饲料添加剂用于动物的养殖。魔芋精粉中含有丰富的 甘露聚糖，约占70 85%，是5个葡萄糖分子和8个甘露糖分子构成的聚合体。我国又是 魔芋生产大国，这无疑是魔芋成为制备甘露寡糖最优良的原料，随着甘露寡糖在词料业中 的需求越来越大，如何高效的获得甘露寡糖日益受到科研工作者的关注，而甘露寡糖的制 备与e-甘露聚糖酶的酶活及其作用条件有着密切的关系，因此，从自然界中筛选产酶较 高的菌株和研究甘露寡糖的制备条件是关键。 发明内容本发明的目的是提供一种0 -甘露聚糖酶的产生菌及其制备方法，以及用该菌生产0 -甘露聚糖酶的方法。本发明的技术方案为0-甘露聚糖酶的产生菌分类命名为芽孢杆菌(5aw7A/ssA )， 其保藏登记号为CGMCC No.2078，保藏日期为2007年7月3日，保藏单位中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。1、 菌株的分离采集魔芋种植地中的土样加入至富集培养基中，以魔芋精粉做为唯一碳源于37"C富集 72小时；取土样上清液于试管中，按常规稀释梯度稀释后在筛选平板上进行平板涂布分离 稀释，于恒温培养箱中37'C培养24小时；在分离平板中滴加浓度为1%的刚果红溶液适量， 挑取有淡黄色透明圈者，划线分离纯化，37'C培养24小时，纯化2-3次；纯化后将其菌株 接入液体发酵培养基摇瓶发酵，进一步初筛和复筛，最终分离筛选到分解利用魔芋精粉能 力强、产e-甘露聚糖酶酶活高的菌株CD-6 (自命名)。本菌株的16SrRNA基因见说明书 的系列表。该菌株接种到已灭菌的含魔芋精粉的液体发酵培养基中(含魔芋精粉发酵培养经灭菌 后为粘稠状固体，未接种菌株的魔芋精粉的液体发酵培养基作为对照)，将它们同时置于 37°C， 200r/min条件下发酵24小时后，接种该菌株的发酵培养基魔芋精粉有粘稠状固体 变成非粘稠状液体，这是由于该菌株产生的e-甘露聚糖酶将培养基中的甘露聚糖降解为 甘露寡糖，使其粘性降低，而对照液体发酵培养基中不接种此菌，故魔芋精粉培养基仍是 粘稠状固体。分离筛选所用培养基为富集培养基(g/L)魔芋精粉20， KH2PO40.5 ， pH自然；分离培养基(g/L)魔芋精粉5.0 ，酵母膏2.0 ，蛋白胨10，KH2PO4 0.1 ，MgS04*6H20 0.12，琼脂20.0 ， pH自然；双层平板筛选培养基(g/L)上层魔芋精粉2，下层酵母膏l，蛋白胨IO， pH自然；发酵培养基(g/L):魔芋精粉20.0，酵母粉5.0， NaN03 5.0， MgS04 6H20 0. 2， K2HP04' 5.0， pH自然。2、 菌株的初步鉴定根据《常见细菌系统鉴定手册》以及《微生物学实验手册》对其进行形态特征、培养 特征，生理生化测定等方面的初步鉴定。菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌，具有荚膜。能在20 6(TC温度范围内生长，最适生长温 度为37~50°C ，生长pH是5~11,最适生长pH为7~8。能水解淀粉，能耐7%的NaCl生长， 硝酸盐还原、过氧化氢酶测定、V.P实验、柠檬酸盐及丙酸盐利用、亚硝酸盐还原、明胶 液化、甲基红实验、酪素水解结果为阳性，硫化氢实验、吲哚实验结果为阴性。该菌株经 鉴定为芽孢杆菌属(^ac/L "s印.)。3、 菌株的发酵将种子培养液接入装有30ml魔芋精粉发酵培养基的250ml三角瓶中，置于迴转式恒 温调速摇瓶柜中进行好氧发酵，转速为200r/min， 37'C发酵24小时。发酵液离心，取上清 液，即为e-甘露聚糖酶，置于4'C保存。所用培养基为种子培养基(g/L):氯化钠IO，蛋白胨IO，酵母膏5，琼脂20。 发酵培养基(g/L):魔芋精粉20.0，酵母膏5.0， K2HP045g， MgCl2 ,0 0. 2, NaN03 5. 0， pH5. 5。4、 酶活测定方法(DNS法)和粗酶酶学性质1) DNS法测定酶活取干净试管用蒸馏水洗两次，于20mL试管A， B中，分别加入质量分数为0. 5%的角 豆胶溶液(用0.05mol/L Na2HP04' 12H20-0. 02 5mol/L柠檬酸缓冲液配制)0. 9mL，不同温 度预热5min，在A管中加入0. lmL适当稀释的酶液，立即摇匀，在此温度下准确反应lOmin， 立即在A、 B中各加入2. OmL DNS试剂，B管补加0. lmL适当稀释的酶液(该酶液经沸水浴 保温10min)，沸水保温5min，冷却后各加入蒸馏水5mL，混匀。以B管为空白，在540nm 处测定OD值。酶活力定义在本实验条件下，以每分钟水解底物产生lMmol相当于D-甘露糖的还原 糖的酶量定义为一个p-甘露聚糖酶单位(U/ml)。2) 粗酶酶学性质a、 酶反应的最适温度与最适pH值使0-甘露聚糖酶在pH5.0的缓冲液中，在不同温度下(30°C、 35°C、 40°C、 45°C、 50°C、 55°C、 60°C、 65°C、 70°C、 75°C)进行酶促反应，测其酶活，所得结果如图1。结 果表明其酶反应在温度为50-7(TC范围内酶活性变化不大，最适温度为65'C。配制不同pH 值(4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0)的柠檬酸缓冲液，底物角豆胶在 不同的pH缓冲液中，6(TC下进行酶促反应，测其酶活，所得结果如图2。结果表明在e-甘露聚糖酶的pH为4.5-6.5范围内，酶活性变化不大，最适pH为5.0。b、 0-甘露聚糖酶的pH稳定性试验将不同pH值(4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0)的柠檬酸缓冲液配
制的酶液分别置于6(TC水浴中保温60min后，测其酶活，所得结果如图4。结果表明该e -甘露聚糖酶具有较好pH稳定性，在pH4. 0-6. 0范围内处理lh后酶活性均维持在的80% 以上。c、 e-甘露聚糖酶的热稳定性试验将酶液置于不同温度(40°C、 45°C、 50°C、 55°C、 60°C、 65°C、 70°C、 75°C)的水浴 中保温15min，所得结果如图5。在65匸下处理15min，其剩余酶活还有70%以上。本发明筛选到产e -甘露聚糖酶的优良菌株，该菌株所产e -甘露聚糖酶粗酶液酶反应的最适pH为4.5-6.5左右，最适温度为65"C，具有较好的pH稳定性和热稳定性，在不同 的pH条件下保温lh后，在pH4.0-6.0的范围内，酶活性均维持在80%以上。在65T:下处 理15min，其剩余酶活还有70%以上。相比较而言，比已报道的0-甘露聚糖酶有较好的反 应温度和pH。
图1是本发明的菌株电镜扫描图。图2是本发明的酶反应的最适温度曲线图。图3是本发明的酶反应的最适pH曲线图。图4是本发明的pH对酶稳定性的影响曲线图。图5是本发明的酶的热稳定性曲线图。本发明的微生物保藏日期为2007年7月3日，保藏单位简称CGMCC，保藏编号 CGMCC No. 2078。
具体实施方式
实施例h1、菌株的分离采集魔芋种植地中的土样5g加入至100ml富集培养基中，以魔芋精粉做为唯一碳源， 于37。C富集72小时；取土样上清液100iil于试管中，按常规稀释梯度(10—'， l(T2， 10—3， 10—4， 10—5)稀释后在双层平板筛选上进行平板涂布分离，于恒温培养箱中用筛选培养基37°C 培养24小时；在分离平板中滴加浓度为P/。的刚果红溶液10ml左右，挑取有淡黄色透明圈 者，在分离培养基上划线分离纯化，37'C培养24小时，纯化2-3次；纯化后将其菌株接入 液体发酵'培养基摇瓶发酵，进一步初筛和复筛，最终分离筛选到产0-甘露聚糖酶酶活高 的菌株CD-6。本菌株的16SrRNA基因见说明书的系列表。
该菌株接种到已灭菌的含魔芋精粉的液体发酵培养基中，将它们同时置于37°C， 200r/min条件下发酵24小时后，接种该菌株的发酵培养基魔芋精粉有粘稠状固体变成非 粘稠状液体。分离筛选所用培养基为富集培养基(g/L)魔芋精粉20， KH2PO40.5 ， pH自然；分离培养基(g/L)魔芋精粉5.0 ，酵母膏2.0 ，蛋白胨10，KH2PO4 0.1 ，MgS(V6H20 0.12，琼脂20.0 ， pH自然；筛选培养基(g/L)上层魔芋精粉2，下层酵母膏l，蛋白胨IO， pH自然；发酵培养基(g/L):魔芋精粉20. 0，酵母粉5. 0， NaN03 5. 0， MgS04 6H20 0. 2， K2HP04 5.0, pH自然。2、 菌株的初步鉴定根据《常见细菌系统鉴定手册》以及《微生物学实验手册》对其进行形态特征、培养 特征，生理生化测定等方面的初步鉴定。菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌，具有荚膜。能在20 6(TC温度范围内生长，最适生长温 度为37~50°C，生长pH是5~11,最适生长pH为7 8。能水解淀粉，能耐7%的NaCl生长， 硝酸盐还原、过氧化氢酶测定、V.P实验、柠檬酸盐及丙酸盐利用、亚硝酸盐还原、明胶 液化、甲基红实验、酪素水解结果为阳性，硫化氢实验、吲哚实验结果为阴性。该菌株经 鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。3、 β-甘露聚糖酶制备种子培养基(g/L):氯化钠IO，蛋白胨IO，酵母膏5，琼脂20。 将种子培养液接入装有30ml魔芋精粉发酵培养基的250ml三角瓶中，置于迴转式十亘温调速摇瓶柜中进行好氧发酵，转速为200r/min， 37'C发酵24小时，发酵液离心，取上清液，即e-甘露聚糖酶，置于4'C保存。 所用培养基为种子培养基(g/L):氯化钠IO，蛋白胨IO，酵母膏5，琼脂20。 发酵培养基(g/L):魔芋精粉20.0，酵母膏5.0， K2HP045g， MgCl2.6H20 0. 2，NaNO3 5. 0， pH5. 5。16SrRNA基因系列表
权利要求
1、一种β-甘露聚糖酶的产生菌，其特征在于β-甘露聚糖酶的产生菌分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.，其保藏登记号为CGMCC No.2078。
2、 根据权利要求1所述的e-甘露聚糖酶的产生菌，其特征在于该菌株的16SrRNA基 因为>strainCD6CACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGAT
3、 权利要求i所述的e-甘露聚糖酶的产生菌的制备方法，其特征在于按以下制备采集魔芋种植地中的土样加入至富集培养基中，以魔芋精粉做为唯一碳源于37'C富集72 小时；取土样上清液于试管中，按常规稀释梯度稀释后，在筛选平板上进行平板涂布分离， 于恒温培养箱中37'C培养24小时；在分离平板中滴加浓度为1%的刚果红溶液适量，挑取 有淡黄色透明圈者，划线分离纯化，37'C培养24小时，纯化2-3次；纯化后将其菌株接入 液体发酵培养基摇瓶发酵，进一步初筛和复筛，最终分离筛选到e-甘露聚糖酶产生菌菌 株。
4、 用权利要求1所述的P-甘露聚糖酶的产生菌制备P-甘露聚糖酶的方法，其特征 在于利用魔芋精粉发酵培养基，将种子培养液接入装有魔芋精粉的发酵培养基的三角瓶 中，置于迴转式恒温调速摇瓶柜中进行好氧发酵，转速为200r/min， 37'C发酵24小时，发 酵液离心，取上清液即为P-甘露聚糖酶。
全文摘要
本发明是一种β-甘露聚糖酶的产生菌及其制备方法。β-甘露聚糖酶的产生菌分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.，其保藏登记号为CGMCC No.2078。该菌株所产β-甘露聚糖酶粗酶液酶反应的最适pH为4.5-6.5左右，最适温度为65℃，具有较好的pH稳定性和热稳定性，在不同的pH条件下保温1h后，在pH4.0-6.0的范围内，酶活性均维持在80％以上。在65℃下处理15min，其剩余酶活还有70％以上。相比较而言，比已报道的β-甘露聚糖酶有较好的反应温度和pH。
文档编号C12N1/20GK101157903SQ20071006620
公开日2008年4月9日 申请日期2007年9月17日 优先权日2007年9月17日
发明者蕾 段, 波 许, 黄遵锡 申请人:云南师范大学