专利名称：一种胶原蛋白酶产生菌的制作方法
技术领域：
本发明属于工业微生物筛选应用技术领域，更具体地说是涉及一种胶原蛋白酶产生菌。
背景技术：
胶原蛋白酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase),它能在生理pH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。目前，胶原蛋白酶主要用于医学和科学研究。在临床上胶原蛋白酶主要应用于烧伤、创伤的创面治疗，以及增生性瘢痕、腰椎间盘突出的治疗等。在科学研究方面，胶原蛋白酶主要用于消化生物的器官组织获得原代细胞。研究表明，胶原蛋白酶除了用于临床医学及科学研究外，胶原蛋白酶还参与角质层新陈代谢，延缓皮肤老化的速度，达到美容功效；而且胶原蛋白酶特异水解胶原蛋白获得胶原蛋白的基本结构——胶原三肽，可以直接补充人体胶原蛋白，达到延缓皮肤衰老达到美容养颜功效。然而，目前用于临床医学及科学研究的胶原蛋白酶大都是克隆来自溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)的胶原酶基因,然后在大肠杆菌(E.coli)中表达,梭菌及大肠杆菌的毒性影响了其在食品、化妆品行业中的应用。本发明的目的就是要解决胶原蛋白酶在食品、化妆品行业中的应用难题，为食品、化妆品行业提供一种安全且高效的胶原蛋白酶产生菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种胶原蛋白酶产生菌，即一株能够高效表达胶原酶的枯草芽孢杆菌新菌种，以及该菌种在胶原蛋白水解中的应用，即将该菌种产生的胶原蛋白酶应用于水解胶原蛋白获得富含胶 原三肽的胶原蛋白粉，解决现有技术所获得产品分子量不均一、胶原三肽含量低等缺点。本发明首先提供一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis菌株，已于2013年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏号为=CGMCC N0.7567。枯草芽孢杆菌Col04菌株的生长温度范围为30-45°C，最佳生长温度为37°C;生长的pH值范围为6.0-8.0，最适pH值为7.0，使用的培养基为LB培养基。本发明的菌株可将胶原蛋白和明胶降解成胶原三肽。所述的菌株用于降解胶原蛋白或明胶，其工艺为:使用产酶培养基(产酶培养基成分如下:葡萄糖20g/L,酵母提取物1.5 g/L,胰蛋白胨10g/L,氯化I丐0.05 g/L,硫酸猛
0.165 g/L，磷酸氢二钾0.25 g/L，磷酸二氢钠0.5 g/L,pH 7.5)培养该菌株48小时，然后离心除去菌体，得到的发酵液用于胶原蛋白或明胶的降解。将胶原蛋白或明胶加入发酵液中，调节pH6.0-8.0，温度35-50°C条件下降解胶原蛋白或明胶。本发明的枯草芽孢杆菌Col04菌株具有营养要求简单、生长快速，产胶原蛋白酶活性高等优点。研究表明，枯草芽孢杆菌Col04菌株产的胶原蛋白酶对大部分金属离子不敏感、PH范围宽广、胶原蛋白酶活性高、耐受温度能力比之前发现的来源于其他菌株的胶原蛋白酶强，而且该菌株具有安全无毒的特点，利用该菌株进行胶原蛋白或明胶的降解并用于食品和化妆品行业将具有广阔的经济前景。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。一、枯草芽孢杆菌Col04菌株的筛选申请人:以天津市肉联二厂附近的土壤样品作为基质，先经LB+5%明胶培养基富集培养，然后稀释后涂布到含有10%明胶的LB平板，pH7.0，37°C培养获得了本发明的菌株。对该菌株16s rRNA基因序列进行鉴定，该菌株鉴定为枯草芽孢杆。进一步参考《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版，科学出版社)，并与枯草芽孢杆菌标准菌株生理生化试验对比，发现该菌株与标准菌株在某些特征方面有较明显的差异，是一株新型的枯草芽孢杆菌菌株。二、枯草芽孢杆菌Col04菌株的形态、理化参数1、枯草芽孢杆菌Col04菌株的形态特征枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Col04菌株为杆状，菌落表面粗糙不透明、污白色或微黄色，其菌体长约2.0-3.0ym,菌体宽度为0.7-0.8 μ m。染色结果显示为革兰氏阳性菌，其芽孢端生，约0.6-0.9 μ m,为椭圆形，不膨大。菌体不具有荚膜，具有侧生的鞭毛，能运动。2、培养条件枯草芽孢杆菌Col04菌在普通培养基上即可生长，当在LB琼脂培养基上37°C培养24小时，菌落表面粗糙无光泽，浅黄色或灰白色不透明，边缘不整齐，直径3.0-6.0mm。在1%葡萄糖洋菜液体培养基上培养时会混浊生长，形成菌膜，无沉淀现象。枯草芽孢杆菌Col04菌的生长温度范围为35 50°C，通过细胞计数检测，发现在37°C下，细胞传代繁殖时间最短，是该菌的最佳生长温度。另外，枯草芽孢杆菌Col04菌株培养是在好氧条件下进行，培养基的pH范围为
6.0-8.0,即该菌在偏中性条件下生长繁殖，pH为7.5是其最适的生长条件。3、生化反应参数枯草芽孢杆菌Col菌株生理生化试验结果如下表I表1:枯草芽孢杆菌Col菌株生理生化试验
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC N0.4500。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其生长温度范围为30-45°C，；生长的pH值范围为 6.0-8.0。
3.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌，其生长温度为37°C。
4.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌，生长的pH值范围为7.0。
5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在将胶原蛋白或明胶降解成胶原三肽中的应用。
6.一种应用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其工艺为:使用产酶培养基培养该菌株48小时，然后离心除去菌体，得到的发酵液用于胶原蛋白或明胶的降解；将胶原蛋白或明胶加入发酵液中，调节PH6.0-8.0，温度35-50°C条件下降解胶原蛋白或明胶，其中产酶培养基成分如下:葡萄糖2(^/1，酵母提取物1.5 g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钙0.05 g/L，硫酸锰0.165 g/L，磷酸氢二钾0.25 g/L，磷酸二氢钠0.5 g/L,pH 7.5 。
全文摘要
本发明涉及一种株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Col04菌株，其保藏编号为CGMCC NO.4500。本发明的枯草芽孢杆菌Col04菌株具有营养要求简单、生长快速，产胶原蛋白酶活性高等优点。研究表明，枯草芽孢杆菌Col04菌株产的胶原蛋白酶对大部分金属离子不敏感、pH范围宽广、胶原蛋白酶活性高、耐受温度能力比之前发现的来源于其他菌株的胶原蛋白酶强，而且该菌株具有安全无毒的特点，利用该菌株进行胶原蛋白或明胶的降解并用于食品和化妆品行业将具有广阔的经济前景。
文档编号C12R1/125GK103232963SQ20131019910
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月27日 优先权日2013年5月27日
发明者郑振琴 申请人:天津益丽康生物科技有限公司