专利名称：一种鞣制动物标本皮张dna的提取方法
技术领域：
本发明涉及生物DNA技术领域，具体涉及一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法。
背景技术：
随着科技的发展，DNA分子标记技术已广泛应用于生物基因组研究，生物的遗传育种、起源进化、分类、医学及法医破案等诸多方面，并成为现代分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。这些都是针对DNA的研究，所以提取到高纯度，高浓度的DNA是所有研究的基础。对于动物DNA的提取，最常见的是从肌肉、血液以及各种内脏中获得，因为这些组织的DNA含量多，组织处理较容易，提出的DNA片段较完整，适用于各种分子生物学研究。但是野生动物的分子遗传学研究经常受到个体数量、样品来源地的空间分布、样品采集时间跨度等的限制。要获得一些动物的肌肉、血液，或者内脏等实验材料都是非常困难的，对于一些己经灭绝的动物来说，这根本就是不可能的。因此在进行分子生物学研究时，需要馆藏鞣制动物标本来补充野外标本收集的不足。目前鞣制动物标本皮张DNA的提取采用的是常规的动物DNA的提取方法，但是实践证明从标本中提取DNA往往是不可行的。因为这些标本大多都经过各种处理，含有大量水溶性重金属离子、鞣剂等酶抑制剂等，对DNA提取会有一定程度的干扰，导致从这些样品中提取的DNA量一般都比较少，在进行PCR扩增检查DNA提取时，仅有不到10%能够扩增出条带，显示提取到DNA。因此现有技术存在的问题是:DNA提取量小且有重金属离子，PCR扩增结果低，不适用于进行分子生物学研究。发明内容:
本发明的目的是要提供一种高效的鞣制动物标本皮张DNA的提取方法，以克服现有技术存在的DNA提取量小且有重金属离子，PCR扩增结果低，不适用于进行分子生物学研究的问题。·本发明的目的是这样实现的，一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法，依次包括下述步骤:
O原料的处理:
①将经过鞣制处理的动物标本皮张在常温下用酒精浸泡，再用蒸馏水冲洗至无杂物备
用；
②剪取皮张，用Na2HPO4溶液在不断振荡条件下处理2(Γ28小时，用蒸馏水冲洗2 3遍；
2)消化:
将标本用浸泡液浸泡1.5^2.5小时，弃浸泡液，用剪刀尽量剪碎，置于离心管内，向离心管内加入500μ1消化液，24ul 0.5mol/L EDTA，6ul 20mg/ml蛋白酶K，在55°C下存放3-5小时；离心分离，取200 μ I上清液于另一离心管中；
所述浸泡液为 10mmol/L Tris - HC1、100mmol/L EDTAUOOmmoI/L NaCl, pH8.0 ；
3)分离、沉淀:
向离心管中加入200 μ ITris-饱和酚(ρΗ8.0)，轻轻地摇动混合8 12分钟，离心分离，重复此步骤一次；将上清移至一个新的离心管中，再加入200 μ I氯仿，轻轻地摇动混合8^12分钟，离心分离，取上清并重复此步骤一次；取上清移入一个新的离心管中，加入2.5倍体积的冷无水乙醇，轻轻地摇动片刻，置于冰箱中于-20 °C条件下冷冻25 35分钟；离心分离，小心弃去上清；吸取200 μ L70%乙醇洗涤片刻，离心分离，小心弃去上清，室温下打开离心管盖,使乙醇蒸发10-20分钟；用30 μ I TE (10 mmol/L Tris - HCl> 10 mmol/LEDTA, pH8.0)缓冲液室温下溶解DNA沉淀；
4) 二次抽提:
向提取好的DNA溶液中加入7uL完全悬浮的DNA IQ 系统中的DNA IQ 树脂，高速涡旋振荡数秒钟，并进行磁分离，分离结束后，将DNA溶液小心地转移到容器中。上述步骤2)中消化液为Promega公司生产的Nuclei Lysis Sol’ η试剂。上述步骤4)中的磁分离步骤包括下述步骤:
①将管子放在磁分离架上，磁分离立刻进行。小心去除所有溶液，不要触碰管壁上的树月旨，加入100 μ L裂解缓冲液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡数秒，将管子放回到磁分离架上，并去除所有的裂解液；
②加入100μ L配制的I X洗涤液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡数秒，将管子放回到磁分离架上，去掉所有洗涤液；打开盖子，将管子放在磁分离架上，空气中干燥，加入25-100 μ L洗脱液，盖上管盖并高速涡旋振荡数秒；
③65°C温育51分钟，取出温育的管子，高速涡旋振荡数秒，立即放到磁分离架上，分尚结束。与现有技术相比，本发明的优点是:
1、本发明可有效去除重金属离子，产品浓度大，纯度高，可以用来做PCR扩增等分子实验，在进行PCR扩增检测DNA时，有85%以上的样品能够扩增出条带，显示提取到DNA。2、本发明适用于所有经过鞣制处理的标本皮张，也可用于皮革制品的真假鉴定、非法贸易野生动物制品物种鉴定等也可用于皮革制品的真假鉴定、非法贸易野生动物制品物种鉴定等工作。
具体实施方式
:
下面将结合实施例对本发明进行详细地说明。实施例1:
一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法，依次包括下述步骤 O原料的处理:
①将经过鞣制处理的林麝标本皮张在常温下用酒精浸泡半小时，再用蒸馏水冲洗至无杂物备用；
②剪取约0.5 Cm2的皮张，用Iml 0.03M Na2HPO4溶液在不断振荡条件下处理24小时，用蒸馏水冲洗3遍；
2)消化:
将标本用浸泡液(10mmol/L Tris - HC1、100mmol/L EDTAUOOmmoI/L NaCl, pH8.0)浸泡2小时，弃浸泡液，用剪刀尽量剪碎，置于1.5ml离心管内，向离心管内加入500 μ I消化液(Promega 公司生产的 Nuclei Lysis Sol’η 试剂),24ul 0.5mol/L EDTA, 6ul 20mg/ml蛋白酶K，在55°C下存 放3小时；12000r/min离心5分钟，取200 μ I上清液于另一离心管中；
3)分离、沉淀:
向离心管中加入200 μ ITris-饱和酚(ρΗ8.0)，轻轻地摇动混10分钟，12000 r/min离心10分钟，重复此步骤一次；将上清移至一个新的1.5ml离心管中，再加入200 μ I氯仿，轻轻地摇动混合10分钟，12000 r/min离心10分钟，取上清并重复此步骤一次；取上清移入一个新的1.5ml离心管中，加入2.5倍体积的冷无水乙醇，轻轻地摇动片刻，置于冰箱中于-20 °C条件下冷冻30分钟；13000 r/min离心15 min,小心弃去上清；吸取200 μ L70%乙醇洗涤片刻，13000 r/min离心15分钟，小心弃去上清，室温下打开离心管盖，使乙醇蒸发20分钟；用 30μ1 TE (10 mmol/L Tris - HClUO mmol/L EDTA, ρΗ8.0)缓冲液室温下溶解DNA沉淀；
4)二次抽提:
向提取好的DNA溶液中加入7uL完全悬浮的DNA IQ 系统中的DNA IQ 树脂，高速涡旋振荡3秒钟，并进行磁分离，所述磁分离步骤包括下述步骤:
①将管子放在MagneSphere 磁分离架上，磁分离立刻进行，小心去除所有溶液，不要触碰管壁上的树脂，加入100 μ L裂解缓冲液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡2秒钟，将管子放回到磁分离架上，并去除所有的裂解液；
②加入100μ L配制的I X洗涤液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡2秒钟，将管子放回到磁分离架上，去掉所有洗涤液，打开盖子，将管子放在磁分离架上，空气中干燥5分钟，加入25 μ L洗脱液，盖上管盖并高速涡旋振荡2秒钟。③65°C温育5分钟。取出温育的管子，高速涡旋振荡2秒钟，立即放到磁分离架上。
分离结束后，将DNA溶液小心地转移到选定的容器中。进行PCR扩增检测DNA，显示提取到DNA。实施例2:
一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法，依次包括下述步骤 O原料的处理:
①将经过鞣制处理的斑羚标本皮张在常温下，用酒精浸泡40分钟、再用蒸馏水冲洗至无杂物备用；
②剪取约Icm2的皮张，用5ml 0.03M Na2HPO4溶液在不断振荡条件下处理28小时，用蒸馏水冲洗3遍；
2)消化:
将标本用浸泡液(10mmol/L Tris - HC1、100mmol/L EDTAUOOmmoI/L NaCl, ρΗ8.0)浸泡2.5小时，弃浸泡液，用剪刀尽量剪碎，置于1.5ml离心管内，向离心管内加入500 μ I消化液(Promega 公司生产的 Nuclei Lysis Sol’η 试剂),24ul 0.5mol/L EDTA, 6ul 20mg/ml蛋白酶K，在55°C下存放5小时；12000r/min离心6分钟，取200 μ I上清液于另一离心管中；
3)分离、沉淀:
向离心管中加入200 μ ITris-饱和酚(ρΗ8.0)，轻轻地摇动混10分钟，12000 r/min离心8分钟，重复此步骤一次；将上清移至一个新的1.5ml离心管中，再加入200 μ I氯仿，轻轻地摇动混合8分钟，12000 r/min离心12分钟，取上清并重复此步骤一次；取上清移入一个新的1.5ml离心管中，加入2.5倍体积的冷无水乙醇，轻轻地摇动片刻，置于冰箱中于-20 °C条件下冷冻35分钟；13000 r/min离心12min，小心弃去上清；吸取200 μ L70%乙醇洗涤片刻，13000 r/min离心12分钟，小心弃去上清，室温下打开离心管盖，使乙醇蒸发15分钟；用 30μ I TE (10 mmol/L Tris - HClUO mmol/L EDTA，ρΗ8.0)缓冲液室温下溶解 DNA沉淀；
4)二次抽提:
向提取好的DNA溶液中加入7uL完全悬浮的DNA IQ 系统中的DNA IQ 树脂，高速涡旋振荡2秒钟，并进行磁分离，所述磁分离步骤包括下述步骤:
①将管子放在MagneSphere 磁分离架上，磁分离立刻进行，小心去除所有溶液，不要触碰管壁上的树脂。加入100 μ L裂解缓冲液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡3秒钟，将管子放回到磁分离架上，并去除所有的裂解液；
②加入100μ L配制的I X洗涤液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡3秒钟，将管子放回到磁分离架上，去掉所有洗涤液，打开盖子，将管子放在磁分离架上，空气中干燥8分钟，加入IOOy L洗脱液，盖上管盖并高速涡旋振荡3秒钟；
③65°C温育8分钟。取出温 育的管子，高速涡旋振荡3秒钟，立即放到磁分离架上。分离结束后，将DNA溶液小心地转移到选定的容器中。进行PCR扩增检测DNA，显示提取到DNA。实施例3:
一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法，依次包括下述步骤 O原料的处理:
①将经过鞣制处理的金丝猴标本皮张在常温下，用酒精浸泡25分钟、再用蒸馏水冲洗至无杂物备用；
②剪取约0.8 cm2的皮张，用3ml 0.03M Na2HPO4溶液在不断振荡条件下处理24小时，用蒸馏水冲洗2遍；
2)消化:
将标本用浸泡液(10mmol/L Tris - HC1、100mmol/L EDTA、IOOmmoI/L NaCl, pH8.0)浸泡1.5小时，弃浸泡液，用剪刀尽量剪碎，置于1.5ml离心管内，向离心管内加入500 μ I消化液(Promega 公司生产的 Nuclei Lysis Sol’η 试剂),24ul 0.5mol/L EDTA, 6ul 20mg/ml蛋白酶K，在55°C下存放3小时；12000r/min离心5分钟，取200 μ I上清液于另一离心管中；
3)分离、沉淀:
向离心管中加入200 μ ITris-饱和酚(ρΗ8.0)，轻轻地摇动混8分钟，12000 r/min离心8分钟，重复此步骤一次；将上清移至一个新的1.5ml离心管中，再加入200 μ I氯仿，轻轻地摇动混合8分钟，12000 r/min离心12分钟，取上清并重复此步骤一次；取上清移入一个新的1.5ml离心管中，加入2.5倍体积的冷无水乙醇，轻轻地摇动片刻，置于冰箱中于-20 °C条件下冷冻25分钟；13000 r/min离心12min，小心弃去上清；吸取200 μ L70%乙醇洗涤片刻，13000 r/min离心12分钟，小心弃去上清，室温下打开离心管盖，使乙醇蒸发15分钟；用 30μ I TE (10 mmol/L Tris - HClUO mmol/L EDTA，ρΗ8.0)缓冲液室温下溶解 DNA沉淀；
4)二次抽提:
向提取好的DNA溶液中加入7uL完全悬浮的DNA IQ 系统中的DNA IQ 树脂，高速涡旋振荡2秒钟，并进行磁分离，所述磁分离步骤包括下述步骤:
①将管子放在MagneSphere 磁分离架上，磁分离立刻进行，小心去除所有溶液，不要触碰管壁上的树脂。加入100 μ L裂解缓冲液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡3秒钟，将管子放回到磁分离架上，并去除所有的裂解液；
②加入100μ L配制的I X洗涤液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡3秒钟，将管子放回到磁分离架上，去掉所有洗涤液，打开盖子，将管子放在磁分离架上，空气中干燥8分钟，加入100 μ L洗脱液，盖上管盖并高速涡旋振荡3秒钟；
③65°C温育8分钟。取出温育的管子，高速涡旋振荡3秒钟，立即放到磁分离架上。分离结束后，将DNA溶液小心地转移到选定的容器中。进行PCR扩增检 测DNA，显示提取到DNA。
权利要求
1.一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法，其特征在于:依次包括下述步骤: O原料的处理: ①将经过鞣制处理的动物标本皮张在常温下用酒精浸泡，再用蒸馏水冲洗至无杂物备用； ②剪取皮张，用Na2HPO4溶液在不断振荡条件下处理2(Γ28小时，用蒸馏水冲洗2 3遍； 2)消化:将标本用浸泡液浸泡1.5^2.5小时，弃浸泡液，用剪刀尽量剪碎，置于离心管内，向离心管内加入500μ1消化液，24ul 0.5mol/L EDTA，6ul 20mg/ml蛋白酶K，在55°C下存放3-5小时；离心分离，取200 μ I上清液于另一离心管中； 所述浸泡液为 10mmol/L Tris - HC1、100mmol/L EDTAUOOmmoI/L NaCl, pH8.0 ； 3)分离、沉淀: 向离心管中加入200 μ ITris-饱和酚(ρΗ8.0)，轻轻地摇动混合8 12分钟，离心分离，重复此步骤一次；将上清移至一个新的离心管中，再加入200μ I氯仿，轻轻地摇动混合8 12分钟，离心分离，取上清并重复此步骤一次；取上清移入一个新的离心管中，加入2.5倍体积的冷无水乙醇，轻轻地摇动片刻，置于冰箱中于-20 °C条件下冷冻25 35分钟；离心分离，小心弃去上清；吸取200 μ L70%乙醇洗涤片刻，离心分离，小心弃去上清，室温下打开离心管盖,使乙醇蒸发10-20分钟；用30 μ I TE (10 mmol/L Tris - HCl> 10 mmol/LEDTA, pH8.0)缓冲液室温下溶解DNA沉淀； 4)二次抽 提: 向提取好的DNA溶液中加入7uL完全悬浮的DNA IQ 系统中的DNA IQ 树脂，高速涡旋振荡数秒钟，并进行磁分离，分离结束后，将DNA溶液小心地转移到容器中。
2.根据权利要求1所述的一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法，其特征在于:所述步骤2)中消化液为Promega公司生产的Nuclei Lysis Sol’ η试剂。
3.根据权利要求1或2所述的一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法，其特征在于:所述步骤4)中的磁分离步骤包括下述步骤: ①将管子放在磁分离架上，磁分离立刻进行，小心去除所有溶液，不要触碰管壁上的树脂，加入100 μ L裂解缓冲液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡数秒，将管子放回到磁分离架上，并去除所有的裂解液； ②加入100μ L配制的I X洗涤液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡数秒，将管子放回到磁分离架上，去掉所有洗涤液；打开盖子，将管子放在磁分离架上，空气中干燥，加入25-100 μ L洗脱液，盖上管盖并高速涡旋振荡数秒； ③65°C温育51分钟，取出温育的管子，高速涡旋振荡数秒，立即放到磁分离架上，分尚结束。
全文摘要
本发明涉及一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法。DNA提取量小且有重金属离子，PCR扩增结果低，不适用于进行分子生物学研究。本发明先将标本皮张在常温下用酒精浸泡，再用蒸馏水冲洗至无杂物，用Na2HPO4溶液在不断振荡条件下处理20~28小时，用蒸馏水冲洗2~3遍；将标本用浸泡液浸泡1.5~2.5小时，置于离心管内，向离心管内加入500μl消化液，再进行离心分离、沉淀；二次抽提时加入7uL完全悬浮的DNAIQTM系统中的DNAIQTM树脂，高速涡旋振荡数秒钟，并进行磁分离，分离结束后，将DNA溶液小心地转移到容器中。本发明可有效去除重金属离子，产品浓度大，纯度高，适用于所有经过鞣制处理的标本皮张。
文档编号C12N15/10GK103243089SQ20131019665
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月24日 优先权日2013年5月24日
发明者冯成利, 冯慧, 任轶, 党蕊叶, 蒋志武 申请人:陕西省动物研究所