专利名称：一种家蚕成品卵中微孢子虫数量水平的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种家蚕成品卵中微孢子虫数量水平的检测方法，特别是一种应用荧光定量PCR微孢子虫的数量水平的方法。
背景技术：
家蚕微粒子病是由微孢子虫OVo1Seffia感染所引起的一种传染性蚕病，该病具有胚种传染性，是蚕种生产中威胁最严重的传染性蚕病。为了制造无毒蚕种，杜绝胚种传染，生产中可通过母蛾显微镜检验法，通过淘汰有毒母蛾所产蚕卵方法杜绝胚种传染。由于单蛾检验工作量大、时间紧，因此又将单蛾检验为集团母蛾检验，并根据概率学原理计算母蛾的带毒率。1979年日本农林水产省编的《微粒子病检查指南》中规定病蛾率0.5%为危险率。1997年，根据行业发展的特点和需要，农业部发布桑蚕一代杂交种检验规程(NY/T327-1997)，规定了母蛾检验操作规程和判别标准。然而，母蛾的带毒率不能直接、准确地反映蚕卵的带毒，因此，用种单位、蚕种检验部门要求进行成品卵检验的呼声也越来越高。在农业部发布桑蚕一代杂交种检验规程(NY/T327-1997)，除了规定了母蛾检验操作规程和判别标准外，还颁布了家蚕成品卵检验的规定和判别标准。该规程规定I个检验集团为100粒左右蚕卵，采用显微镜镜检法，根据有无微粒子孢子判别该集团是否带毒。由于蚕卵中家蚕微孢子的检出率远低于母蛾中微孢子的检出率，错判率高，因此，一般将蚕卵催青孵化后，对蚁蚕进行检验，因此检验周期长，难以满足实际生产。为了提高微孢子虫的检测灵敏度，有部分学者通过LAMP法进行微孢子虫的检测。然而目前的检测方法充其量只能推断成品蚕卵微粒子病病卵率，但难以推断成品卵中微孢子虫的数量，而蚕卵中的微孢子数量对后代群体微粒子病的发生有直接影响。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种家蚕卵中微孢子虫(Ab1Seaa bombycis、数量水平的检测方法，以便更精确评估后续饲养中发生微粒病的风险、满足生产要求。本发明的技术方案如下:
1)提取100粒家蚕卵中微孢子虫DNA；
2)根据家蚕微孢子虫16SrRNA基因序列或5S rRNA基因序列设计一对引物；
3)以步骤I获得的DNA为模板，使用步骤2)合成的引物，进行荧光定量PCR，将获得的Ct值记为S ；
4)使用步骤2)合成的引物，以家蚕微孢子虫DNA为模板，进行PCR扩增，将扩增产物克隆到常规载体，获得克隆载体；
5)将步骤4)获得的克隆载体稀释成一个浓度梯度，以不同浓度梯度克隆载体为模板，使用步骤2)合成的引物，进行荧光定量PCR，使用记录的Ct值对质粒浓度做标准曲线；
6)根据标准曲线 计算出当Ct值为S时的DNA模板拷贝数，进一步获得微孢子虫数量水平。
步骤2)所述引物序列如下:
PCR扩增家蚕微孢子虫16S rRNA基因部分片段时，两个引物序列为:gtacacaccgcccgtcgctatc 和 cctgctaatggttctccaacagc ； PCR 扩增家香微抱子虫5S rRNA基因部分片段时，两个引物序列为:ctcttatccagatacggccata和cccttcttagactaattaagctc。所述常规载体为T-载体，pUC系列载体或pET系列载体，优选PMD19-T。所述孢子发芽诱导液配方为:0.1moI/L K2C03+0.1moI/L KHCO3或0.2mol/L KOH或
0.0lmol/L K0H+0.16mol/L KC1。所述发芽缓冲液配方为0.0lmol/L的磷酸盐缓冲液，pH为6.8-7.2。更具体的步骤如下:
步骤1、提取100粒家蚕卵中微孢子虫DNA，溶解于X微升双蒸水，在其中取Y微升DNA溶液为模板，使用两个合成的引物，进行荧光定量PCR，将获得的Ct值设为S。步骤2、将含微孢子虫DNA序列的重组质粒稀释成一个浓度梯度，以不同浓度的重组质粒为模板，使用两个合·成的引物，进行荧光定量PCR，使用记录的Ct值对质粒浓度做标准曲线。步骤3、根据标准曲线可以计算出当Ct值为S时的DNA模板含量，从而检测得到100粒家蚕卵中微孢子虫数量水平。步骤I所述的提取100粒家蚕卵中微孢子虫DNA包含以下步骤:取100粒蚕卵，25°C下用30%K0H 0.5 ml处理15-30分钟，用双蒸水洗2次，再用0.5ml lmol/L的HCl处理5分钟，再用双蒸水洗2次，加微孢子发芽诱导液(0.lmol/LK2C03+0.lmol/LKHC03*0.2mol/L KOH或0.0lmol/L K0H+0.16mol/L KCl )，匀浆后20_30°C下诱导I小时，离心收集沉淀，力口A 0.5ml发芽缓冲液(0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，pH为6.8-7.2)重悬沉淀，加入0.5ml蛋白酶K (50ii g/ml)，37°C消化I小时，然后用Tris饱和酚(pH为8.0)和氯仿抽提各抽提I次，加入IOu I RNA酶(0.01mg/ml)于37°C消化60分钟，用Tris饱和酚(pH为8.0)和氯仿抽提各抽提I次，再用预冷的无水乙醇沉淀DNA。步骤2所述的两个合成的引物是根据GenBank上已公开的家蚕微孢子虫16S rRNA或5S rRNA的基因序列设计的PCR引物，根据家蚕微孢子虫16S rRNA基因序列设计的两个引物序列为 gtacacaccgcccgtcgctatc (命名为 Nb5_l)和 cctgctaatggttctccaacagc (命名为Nb3_l),根据家蚕微孢子虫5S rRNA基因序列设计的两个引物ctcttatccagatacggccata(命名为 Nb5_2)和 cccttcttagactaattaagctc (命名为 Nb3_2)。步骤I和步骤3中所述的Ct值为PCR反应管内的荧光信号达到所设定的阈值时，所需要的反应循环数。步骤2中所述的重组质粒的构建过程为:以家蚕微孢子虫DNA为模板，以Nb5-1和Nb3-1为一对引物或以Nb5-2和Nb3-2为一对引物，进行PCR扩增产物，将扩增产物连接到T-载体(市售)，获得重组质粒。步骤2所述的浓度梯度为每微升含1，10，100, 1000, 10000个拷贝的质粒。步骤2所述的不同浓度的重组质粒为每微升含1，10, 100, 1000, 10000个拷贝
的重组质粒溶液。步骤2所述的使用记录的Ct值对质粒浓度做标准曲线为以Ct值为纵坐标，起始重组质粒的浓度(质粒拷贝数)的对数值为横坐标，绘制的标准曲线。步骤3所述的根据标准曲线可以计算出当Ct值为S时的DNA模板含量，从而检测得到100粒家蚕卵中微孢子虫数量水平方法为100粒蚕卵中微孢子虫的数量水平=(Ct值为S时的DNA模板拷贝数/Y) XX
本发明与现有技术相比，目前的检测方法只能推断成品蚕卵微粒子病病卵率，但难以推断成品卵中微孢子虫的数量，而利用本发明可以根据检测样品中家蚕微孢子虫DNA的拷贝数直接判别微孢子虫的数量水平，如已知检测基因在家蚕微孢子虫基因组中的数量水平(拷贝数)，则可以推算样品中的微孢子虫数量水平。
具体实施例方式实施例1
基于家蚕微孢子虫bombycis)l&S rRNA基因的拷贝数判别成品卵中家蚕微孢子虫的数量水平。蚕卵的预处理:取100粒蚕卵，25°C下用30%K0H 0.5 ml处理30分钟，用双蒸水洗2次，每次1.2ml，弃水后，再用0.5ml lmol/L的HCl处理5分钟，用双蒸水洗2次，每次1.2ml。蚕卵中微孢子虫DNA的提取:蚕卵加微孢子发芽诱导液(0.lmol/L K2C03，
0.lmol/L KHCO3) 0.5ml，用灭菌牙签将蚕卵捣碎，常温下诱导I小时，3000转/分，离心5分钟，弃上清，加0.5m 0.0lmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)于25°C下放置60分钟，5000转/分，离心10分钟，弃上清，沉淀用0.5ml蛋白酶K (50ii g/ml)37°C消化60分钟，然后用饱和酚、酚/氯仿、氯仿抽提，再用RNA酶(0.01mg/ml)于37°C消化60分钟，酚/氯仿抽提除RNA酶后，加1/10体积3mol/LNaAc (pH=5.4)及2-2.5倍体积预冷的无水乙醇，沉淀DNA，抽干后，将DNA溶解在40微升双蒸水中，4°C保存。Q-PCR检测:根据GenBank上已公开的家香微抱子虫16S rRNA基因序列，设计引物Nb5_l (gtacacaccgcccgtcgctatc)和Nb3_l(cctgctaatggttctccaacagc)。以提取得到的 DNA 为模板,Nb5_l, Nb3_l 为弓 I物，进行 Q-PCR。Q-PCR反应体系:1 微升DNA模板，I 微升 10 pmol Nb5_l，l 微升 10 pmol Nb3_l，10微升 SYBRGreen Real-time PCR Master Mix (市售，Bio-Rad 公司)，7 微升双蒸水。PCR 反应条件:第一个循环 50 ° C，2 min;然后 95 ° C，10 min;接着按 95 ° C，15 sec ；60 ° C，Imin进行40个循环；最后一个循环为95 ° C，15 sec, 60 ° C，30 sec和95 ° C，15sec。记录Ct =28，设S=28。标准曲线制作:以家蚕微孢子虫DNA为模板，Nb5_l，Nb3_l为引物，进行PCR扩增，PCR扩增产物克隆进pMD19-T (市售，TAKARA公司)，经测序验证，获重组质粒pXNb-16 ;提取pXNb-16质粒，紫外吸收法测定提取质粒DNA含量和纯度；根据质粒DNA的长度和浓度计算质粒DNA的拷贝数；用水将质粒DNA稀释，配制每微升分别含1，10，100，1000, 10000个拷贝的质粒溶液；以各个不同梯度的I微升质粒DNA为模板，Nb5_l、Nb3-1为引物，进行Q-PCR0 Q-PCR体系:1微升质粒DNA模板，I微升10 pmol Nb5_l，I微升10 pmol Nb3_l, 10 微升 SYBR Green Real-time PCR Master Mix (市售，Bio-Rad 公司),7微升双蒸水。PCR反应条件:第一个循环50 ° C，2 min;然后95 ° C，10 min;接着按95。C , 15 sec ；60。C, I min 进行 40 个循环；最后一个循环为 95。C, 15 sec, 60° C，30 sec和95 ° C，15 sec。记录不同浓度的I微升质粒DNA为模板的Ct。以Ct值为纵坐标,起始质粒DNA的拷贝数的对数值为横坐标,绘制标准曲线Ct-DNAc^求得回归方程Ct=-3.531gX0+34.3。样品中微孢子数量水平的计算:根据回归方程Ct=_3.531gX0+34.3，计算样品中的起始模板拷贝数NbDNAtl。28=-3.531gX0+34.3IgX0= (34.3-28)/3.53X0=61
100粒蚕卵中微孢子虫的数量水平=NbDNAQ/YXX=61/lX40=244。由此可以认为100粒蚕卵中的微孢子虫数量水平为244。实施例2
基于家蚕微孢子虫OVo1Seffia bombycis) 5SrRNA基因区域的拷贝数判别成品卵中家蚕微孢子虫的数量水平。蚕卵的预处理:取100粒蚕卵，25°C下用30%K0H 0.5 ml处理30分钟，用双蒸水洗2次，每次1.2ml，弃水后，再用0.5ml lmol/L的HCl处理5分钟，用双蒸水洗2次，每次1.2ml。蚕卵中微孢子虫DNA的提取:蚕卵加微孢子发芽诱导液(0.lmol/LK2C03，0.lmol/L KHCO3) 0.5ml，用灭菌牙签将蚕卵捣碎，常温下诱导I小时，3000转/分，离心5分钟，弃上清，加0.5m 0.0lmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)于25°C下放置60分钟，5000转/分，离心10分钟，弃上清，沉淀用0.5ml蛋白酶K (50 y g/ml) 37°C消化60分钟，然后用饱和酚、酚/氯仿、氯仿抽提，再用RNA酶(0.01mg/ml)于37°C消化60分钟，酚/氯仿抽提除RNA酶后，加1/10体积3mol/LNaAc (pH=5.4)及2-2.5倍体积预冷的无水乙醇，沉淀DNA，抽干后，将DNA溶解在40微升双蒸水中，4°C保存。Q-PCR检测:根据GenBank上已公开的家蚕微孢子虫5S rRNA基因区域序列，设计引物Nb5_2(ct cttatccagatacggccata)和 Nb3_2 (cccttcttagactaattaagctc)。以提取得到的 DNA 为模板，Nb5_l, Nb3_l 为引物，进行Q-PCR。Q-PCR反应体系:1微升DNA模板，I微升10 pmol Nb5_2，I微升10 pmolNb3-2,10 微升 SYBR Green Real-time PCR Master Mix (市售，Bio-Rad 公司)，7 微升双蒸水。PCR反应条件:第一个循环50 ° C，2 min;然后95 ° C，10 min;接着按95 ° C，15 sec ；60。C，I min 进行 40 个循环；最后一个循环为 95。C，15 sec, 60。C，30sec和95 ° C ,15 sec。记录Ct =22，设S=22。标准曲线制作:以家蚕微孢子虫DNA为模板，Nb5-2, Nb3-2为引物，进行PCR扩增，PCR扩增产物克隆进pMD18_T (市售，TAKARA公司)，经测序验证，获重组质粒pXNb-5 ;提取pXNb-5质粒，紫外吸收法测定提取质粒DNA含量和纯度；根据质粒DNA的长度和浓度计算质粒DNA的拷贝数；用水将质粒DNA稀释，配制每微升分别含1，10，100, 1000, 10000个拷贝的质粒溶液；以各个不同梯度的I微升质粒DNA为模板，Nb5-2、Nb3-2为引物，进行Q-PCR。Q-PCR体系:1微升质粒DNA模板，I微升 10 pmol Nb5_2,l 微升 10 pmol Nb3-2,10 微升 SYBR Green Real-time PCR Master Mix(市售，Bio-Rad公司)，7微升双蒸水。PCR反应条件:第一个循环50 ° C，2 min;然后95 ° C , 10 min;接着按95 ° C , 15 sec ；60 ° C, I min进行40个循环；最后一个循环为95。C, 15 sec, 60。C,30 sec和95。C , 15 sec。记录不同浓度的I微升质粒DNA为模板的Ct。以Ct值为纵坐标，起始质粒DNA的拷贝数的对数值为横坐标，绘制标准曲线Ct-DNAcit5 Ct= Ct=-3.741gX0+33.5。样品中微孢子数量水平的计算:根据回归方程Ct=Ct=-3.741gX0+33.5，计算样品中的起始模板拷贝数NbDNAtl。22=-3.741gX0+33.5IgX0= (33.5 -22)/3.74X0=I188100粒蚕卵中微孢子虫的数量水平=NbDNAQ/YXX=I 188/1 X50=59400。由此可以认为100粒蚕卵中的微孢子虫数量水平为59`400。
权利要求
1.一种家蚕成品卵中微孢子虫(Abseffia数量水平的检测方法,其特征在于它包括以下步骤: 1)提取100粒家蚕卵中微孢子虫DNA； 2)根据家蚕微孢子虫16SrRNA基因序列或5S rRNA基因序列设计一对引物； 3)以步骤I获得的DNA为模板，使用步骤2)合成的引物，进行荧光定量PCR，将获得的Ct值记为S ； 4)使用步骤2)合成的引物，以家蚕微孢子虫的DNA为模板，进行PCR扩增，将扩增产物克隆到常规载体，获得克隆载体； 5)将步骤4)获得的克隆载体稀释成一个浓度梯度，以不同浓度梯度克隆载体为模板，使用步骤2)合成的引物，进行荧光定量PCR，使用记录的Ct值对质粒浓度做标准曲线； 6)根据标准曲线计算出当Ct值为S时的DNA模板拷贝数，进一步获得微孢子虫数量水平。
2.权利要求1中所述的方法，其特征在于所述家蚕卵中微孢子虫DNA提取步骤为:取100粒蚕卵，25°C下用0.5 ml 30%K0H处理15-30分钟，用双蒸水洗2次，再用0.5ml ImoI/L的HCl处理5分钟，再用双蒸水洗 2次，加微孢子发芽诱导液，匀浆后20-30°C下诱导I小时，离心收集沉淀，加入0.5ml发芽缓冲液重悬沉淀，加入50ii g/ml蛋白酶K 0.5ml，37°C消化I小时，然后用pH 8.0的Tris饱和酚和氯仿抽提各抽提I次，加入0.01mg/ml RNA酶10 ill于37°C消化60分钟，用pH 8.0Tris饱和酚和氯仿抽提各抽提I次，再用预冷的无水乙醇沉淀DNA。
3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤2)所述引物序列如下: PCR扩增家蚕微孢子虫16S rRNA基因部分片段时，两个引物序列为:5，gtacacaccgcccgtcgctatc3，和 5，cctgctaatggttctccaacagc3，； PCR 扩增家香微孢子虫5S rRNA基因部分片段时，两个引物序列为:5’ ctcttatccagatacggccata3，和5’ cccttcttagactaattaagctcS’。
4.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述常规载体为T-载体，pUC系列载体或PET系列载体。
5.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述T-载体为pMD19-T。
6.权利要求1所述的方法，其特征在于所述孢子发芽诱导液配方为:0.lmol/LK2C03+0.lmol/L KHCO3 或 0.2mol/L KOH 或 0.01mol/L K0H+0.16mol/L KCl。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于所述发芽缓冲液配方为0.0lmol/L的磷酸盐缓冲液，pH 为 6.8-7.2。
全文摘要
本发明提供了一种家蚕成品卵中微孢子数量水平的检测方法。根据家蚕微孢子虫DNA序列设计特异性引物，以待检蚕卵内的总DNA为模板，进行荧光定量PCR(Q-PCR)扩增，获取检测样品的Ct值；同时，以不同拷贝数重组家蚕微孢子虫DNA为模板，进行Q-PCR扩增，以Ct值为纵坐标，起始质粒DNA的拷贝数的对数值为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程；根据回归方程和检测样品的Ct值计算检测样品中家蚕微孢子虫DNA起始拷贝数，从而推测样品中家蚕微孢子虫的数量水平。本发明可以根据检测样品中家蚕微孢子虫DNA的拷贝数直接判别微孢子虫的数量水平。根据成品卵中微孢子虫的数量水平评估后续饲养中发生微粒病的风险比根据成品蚕卵微粒子病病卵率评估更科学。
文档编号C12Q1/68GK103243170SQ20131019600
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月24日 优先权日2013年5月24日
发明者许刚, 秦鸿斌 申请人:江苏省蚕种公司