专利名称：从动物加工副产物中提取rna活性物的方法
技术领域：
本发明涉及核酸技术领域，尤其是从动物加工副产物中提取RNA活性物的方法。
背景技术：
核糖核酸(Ribonucleic acid)，简称RNA，无论是在医药、保健品、食品加工业，还是在植物生长和预防病虫害方面都有非常广泛的应用前景，得到了欧美许多国家的高度重视。在肉食动物加工副产物，如胰脏、脾脏、淋巴、胎盘、胸腺、小肠、肝脏、脑等中存在RNA， 而随着肉食动物加工副产物数量日益增多，除了少数被食用外，大多数被丢弃，这不仅浪费了生物资源，还对生态环境造成了一定的污染。因此如何充分利用动物食品加工副产物制成高价值的RNA产品，同时减少环境污染是一项非常重要的研究工作，具有显著的社会和经济意义。由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很多样。目前国内外主要从微生物、动物中提取RNA。提取制备工艺主要有去污剂法、盐酸胍法、稀碱法和浓盐法等，以及申请人早先申请的ZL200310109446. X，“注射用人胎盘核糖核酸的制备方法”发明专利。只是工业上目前通常采用稀碱法和浓盐法提取RNA，但用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，不具有生物活性。
发明内容
本发明针对不足，提出一种从动物加工副产物中提取RNA活性物的方法，制得的 RNA具有较高的生物活性，以及含量更高。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案一种从动物加工副产物中提取RNA活性物的方法，包括以下步骤①、配制下述试剂试剂A :0. lmol/1的醋酸盐缓冲液中包含0. 4 0. 6wt %的十二烷基硫酸钠、 0. 1 % 0. 3wt %的聚乙烯硫酸酯、0. 1 % 0. 3wt %乙二胺四乙酸二钠，用醋酸调节其PH值至 5.0 ；试剂B 将0. Iwt %的8-羟基喹啉苯酚与试剂A等体积混合，振摇200 400次， 避光静置8 14小时，取上层液体；试剂C 缓冲液饱和酚将0. Iwt %的8-羟基喹啉苯酚与试剂A等体积混合，振摇 200 400次，避光静置8 14小时，取下层液体；②、取新鲜的动物加工副产物，于0 8°C下破碎；③、向步骤②破碎物中加入4 6倍重量的试剂B禾Π 4 6倍重量的试剂C，勻浆处理，离心取上清液加入0. 05 0. 30g/L蛋白酶，于30 50°C水浴30 50min ；冷却至 0 10°C ；④、取步骤③冷却液的上层，加乙醇醇沉，得产品。优选的，步骤②破碎至原料尺寸为5 10 μ m。
优选的，步骤③中蛋白酶为木瓜蛋白酶或中性蛋白酶。优选的，该方法包括纯化过程向步骤④产品中加入0. 3mol/L的醋酸盐缓冲液， 搅拌，离心分离，取上清液；向上清液中加入2 3倍重的-10 -20°C的无水乙醇，保温 1 2小时，离心分离，得沉淀物。与现有技术相比，本发明采用复合溶剂和酶法集成技术，从来动物加工副产物中提取RNA活性物，得到的RNA的生物活性(增色效应)可达30%左右，RNA含量达到60mg/ ml左右。
具体实施例方式一种从动物加工副产物中提取RNA活性物的方法，包括以下步骤①、配制下述试剂试剂A :0. lmol/1的醋酸盐缓冲液中包含0. 4 0. 6wt %的十二烷基硫酸钠、 0. 1 % 0. 3wt %的聚乙烯硫酸酯、0. 1 % 0. 3wt %乙二胺四乙酸二钠，用醋酸调节其PH值至 5.0 ；试剂B 将0. Iwt %的8-羟基喹啉苯酚与试剂A等体积混合，振摇200 400次， 避光静置8 14小时，取上层液体； 试剂C 缓冲液饱和酚将0. Iwt %的8-羟基喹啉苯酚与试剂A等体积混合，振摇 200 400次，避光静置8 14小时，取下层液体；②、取新鲜的动物加工副产物，于0 8°C下破碎；③、向步骤②破碎物中加入4 6倍重量的试剂B和4 6倍重量的试剂C，勻浆处理，离心取上清液加入0. 05 0. 30g/L蛋白酶，于30 50°C水浴30 50min ；冷却至 0 10°C ；④、取步骤③冷却液的上层，加乙醇醇沉，得产品。下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。实施例1以牛胰脏制备RNA活性物为例，其工艺优化情况简要介绍如下1)提取牛胰脏组织，经5°C低温细胞破碎处理至5 μ m,加入4倍重量的试剂B和6倍重量的试剂C，勻浆处理，离心取上清液加入0. 05g/L木瓜蛋白酶，于50°C水浴30min ；冷却至 IO0C ；在30°C下将原料处理约30min，处理结束后冷却分层，上层为核酸层，中间为蛋白层， 下层为溶剂层。2)分离纯化方法、浓缩方法取上层核酸层，通过乙醇沉淀浓缩，除去乙醇得到半固体纯品。加入0.3mol/L的醋酸盐缓冲液，搅拌，离心分离，取上清液；向上清液中加入2倍重的-20°C的无水乙醇，保温1小时，离心分离，得沉淀物。实施例2以牛胎盘制备RNA活性物为例，其工艺优化情况简要介绍如下1)提取
胎盘组织，经0°C低温细胞破碎至10 μ m后，加入6倍重量的试剂B和4倍重量的试剂C，勻浆处理，离心取上清液加入0. 30g/L中性蛋白酶，于30°C水浴50min ；冷却至0°C ； 分层，上层为核酸层，中间为蛋白层，下层为溶剂层。2)分离纯化方法、浓缩方法取上层核酸层，通过乙醇沉淀浓缩，除去乙醇得到半固体纯品。加入0.3mol/L的醋酸盐缓冲液，搅拌，离心分离，取上清液；向上清液中加入3倍重的-10°C的无水乙醇，保温2小时，离心分离，得沉淀物。实施例3以猪肝脏制备RNA活性物为例，其工艺优化情况简要介绍如下1)提取肝脏组织，经0°C低温细胞破碎至10 μ m后，加入6倍重量的试剂B和4倍重量的试剂C，勻浆处理，离心取上清液加入0. 30g/L中性蛋白酶，于30°C水浴50min ；冷却至0°C ； 分层，上层为核酸层，中间为蛋白层，下层为溶剂层。2)分离纯化方法、浓缩方法取上层核酸层，通过乙醇沉淀浓缩，除去乙醇得到半固体纯品。加入0.3mol/L的醋酸盐缓冲液，搅拌，离心分离，取上清液；向上清液中加入2. 3倍重的-12°C的无水乙醇， 保温1. 6小时，离心分离，得沉淀物。对上述实施例产品进行检测，其结果如下表1所示表IRNA活性物产品检测结果
权利要求
1.一种从动物加工副产物中提取RNA活性物的方法，包括以下步骤①、配制下述试剂试剂A :0. lmol/1的醋酸盐缓冲液中包含0. 4 0. 6wt %的十二烷基硫酸钠、0. 0. 3wt%的聚乙烯硫酸酯、0. 0. 3wt%乙二胺四乙酸二钠，用醋酸调节其pH值至5. 0 ； 试剂B 将0. Iwt %的8-羟基喹啉苯酚与试剂A等体积混合，振摇200 400次，避光静置8 14小时，取上层液体；试剂C 缓冲液饱和酚将0. Iwt %的8-羟基喹啉苯酚与试剂A等体积混合，振摇 200 400次，避光静置8 14小时，取下层液体；②、取新鲜的动物加工副产物，于0 8°C下破碎；③、向步骤②破碎物中加入4 6倍重量的试剂B和4 6倍重量的试剂C，勻浆处理，离心取上清液加入0. 05 0. 30g/L蛋白酶，于30 50°C水浴30 50min ；冷却至0 1O0C ；④、取步骤③冷却液的上层，加乙醇醇沉，得产品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤②破碎至原料尺寸为5 10μ m。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤③中蛋白酶为木瓜蛋白酶或中性蛋白酶。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于该方法包括纯化过程向步骤④产品中加入0. 3mol/L的醋酸盐缓冲液，搅拌，离心分离，取上清液；向上清液中加入2 3倍重的-10 -20°C的无水乙醇，保温1 2小时，离心分离，得沉淀物。
全文摘要
本发明公开了一种从动物加工副产物中提取RNA活性物的方法，包括以下步骤①配制下述试剂；②取新鲜的动物加工副产物，于0～8℃下破碎；③向步骤②破碎物中加入4～6倍重量的试剂B和4～6倍重量的试剂C，匀浆处理，离心取上清液加入0.05～0.30g/L蛋白酶，于30～50℃水浴30～50min；冷却至0～10℃；④取步骤③冷却液的上层，加乙醇醇沉，得产品。本发明采用复合溶剂和酶法集成技术，从动物加工副产物中提取RNA活性物，得到的RNA的生物活性(增色效应)可达30％左右，RNA含量达到60mg/ml左右。
文档编号C12N15/10GK102321614SQ201110268448
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月9日 优先权日2011年9月9日
发明者俞保彬, 刘显东, 周天琼, 周正兵 申请人:杭州华津药业股份有限公司