专利名称：一种土壤线虫dna提取方法
技术领域：
本发明涉及动物DNA提取，具体为一种土壤线虫DNA提取方法。
背景技术：
在众多的土壤动物中，线虫是数量和功能类群最丰富的一类。因其形态特殊 性、食物专一性、分离鉴定相对简单，以及对环境变化能做出较迅速的响应等特 点，可将其作为土壤污染效应研究的指示生物。线虫作为指示生物的优越性之一 是易于进行形态鉴定，但是鉴定到种的水平还存在着许多困难。另一个影响线虫 作为指示生物的障碍是样品的数量问题，增加样品的分析量会提供更详尽的空间
信息；但是增加样品在时间和空间上的重复也就意味着增加样品分析的工作量。 由于形态学方法鉴定线虫数目有限，且对线虫形态分类专业知识要求较高，限制 了更多的土壤生态学者从事线虫生态研究。因此， 一些学者尝试利用分子生物学
手段开发出一种简单、快速的线虫鉴定方法。Foucher和Wilson (2002)运用变 性梯度凝胶电泳(DGGE)技术来鉴别混合样品中的线虫种属，并提出该方法相对 于形态学方法更为便捷,且不需要专业的分类学知识。Waite等(2003)利用DGGE 方法测定了欧洲6种草地土壤线虫多样性，但没有将变性梯度凝胶电泳的结果与 形态分析进行比较，这种方法本身的精确性还有待于进一步验证。Foucher等 (2004 )则对Waite等的方法进行了改进，在提取DNA之前，先把线虫从土壤中 提取出来；此方法不但可以分析更多的土壤样品，而且还可以减小扩增非目标生 物的风险。应用分子生物学技术需要注意以下方面l)有效地提取DNA使之可以 代表整个群落；2)提供定量或半定量分组数据使之可以进行群落功能分析；3) 具有处理大量样品的能力。因此，借助分子生物学技术，建立一种土壤线虫DNA 提取方法，对于提高土壤线虫鉴定效率和准确性都具有十分重要的现实意义，有 着广阔的应用前景。
发明内容
本发明目的在于提供一种土壤线虫DNA提取方法。 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下
土壤线虫DNA提取方法将提取的土壤线虫悬液在60-65°C, 2-3分钟下温和 热杀死，将温和热杀死的土壤线虫悬液浓缩后加入其0. 4倍体积的细胞裂解缓冲 液进行冻融处理，再在每微升浓缩后土壤线虫悬液中加入20 pg的蛋白酶K于 36-38'C下140-160转/分钟震荡1-2小时进行保温消化；而后将保温消化的线虫 溶液与等体积的氯仿和异戊醇混合液混合于室温下，以12000转/分钟离心10-12 分钟，提J^K相再加A7K相0.1 <沐积的NaAc和0. 6 ^沐积异丙醇混合，于(TC
3静置2-3小时，再以于4。C下14000-15000转/分钟离心20分钟，沉淀即为土壤 线虫DNA。
所述土壤线虫的提取为将样品淘洗，分别经过60目和400目网筛，而后在样 品中加入过量的硫酸镁以2000转/分钟离心4-5分钟，将悬浮于硫酸镁溶液中的 样品提取出来。所述温和热杀死的土壤线虫悬液按照1: 4的比例浓缩而后加入细 胞裂解缓冲液；所述冻融处理先将悬液在-65'C下放置10分钟，再于65'C下放 置10分钟为一次冻融处理;所述细胞裂解缓冲液于室温下保存，其组成为100 mM Tris、100mMEDTA和1. 5 MNaCl, pH 8. 0;所述加入蛋白酶K后的终浓度为80-100 网/ml。所述氯仿和异戊醇混合液中氯仿与异戊醇体积比为24:1;所述NaAc浓度 为3M，异丙醇为预冷-2(TC。所得土壤线虫DNA自然干燥后将其溶于TE溶液于-20 'C下保存备用。
本发明具有以下优点
1. 较低廉，发明没有釆用DNA提取试剂盒，故成本较低廉，适于线虫群落 DNA的提取。
2. 发明釆用物理、化学、酶法相结合方法对线虫细胞进行裂解，提高了土壤 线虫DNA提取率。
3. 发明釆用先从土壤样品中提取线虫，然后再从线虫悬液中提取DNA的方 法，避免了后续进行PCR时非靶生物DNA的扩增。
图l不同施肥下线虫DNA琼脂糖凝胶电泳检测图(其中Mark:标准；CK:不 施肥；NP:单施化肥N+P; M:单施有机肥；顧P:化肥与有机肥配施)。
具体实施例方式
本发明采用淘洗-过筛-硫酸镁梯度离心方法将线虫从土壤样品中提取出来，
用加热方法将其杀死，得到线虫悬液；然后，在线虫悬液中先加入细胞裂解缓冲 液进行冻融处理，再加入蛋白酶进行保温消化；分别采用氯仿、异戊醇抽提DNA 和NaAc、异丙醇沉淀DNA,室温下自然千燥，即可得到土壤线虫DNA。
实施例1
土壤线虫获取将样品鲜土淘洗，取200 g淘洗鲜土倒入水盆中，加水搅匀， 静置l分钟，倒入一组网筛，上层为60目，下层为400目，边倒边振荡分样筛， 防止水分充满下层400目筛而从筛中溢出，然后再在盆中加入水后混匀，静置l 分钟，倒入网筛中，如此重复3次，将400目分样筛取下，用喷头把400目网 筛中的线虫悬液中的泥浆冲洗干净，倒入另一烧杯中，静置24小时。将静置烧 杯中的上层水轻轻倒掉，只保留大约30ml下层水、线虫和泥浆的混合物。将混 合物轻轻摇匀，倒入离心管中，准备第一次离心，转速2000转/分钟，时间定为 4-5分钟，离心完毕后取出离心管，小心倒掉上层液，保留土层，由于线虫的比 重约为l. 08 g/cm3，比水的比重略大，故线虫与泥土层混在一起。在离心管中注入比重为1. 15 g/cm3的硫酸镁溶液约10ml，进行第二次离心，由于线虫比重比 硫酸镁溶液的比重小，故与泥土分离，悬浮于硫酸镁溶液中，而泥土由于比重较 大而沉入离心管底层，离心完毕后，把离心管内的上层液倒入500目筛中，用水 把硫酸镁液冲掉，然后把线虫液冲入烧杯中，随后转入试管中，静置24小时以 上，以便线虫沉淀。
将提取的土壤线虫悬液在6(TC, 2-3分钟下温和热杀死，其中先将水洛锅温 度设定为6(TC,把静置l小时以上的试管中的上层水小心抽出，只保留大约2-3 ml)，将温和热杀死的土壤线虫悬液1000 pi,在室温下8000转/分钟离心5分钟， 进行浓缩，弃去上面的750 保留下面的250 pl液体，而后加入100 pl细胞裂 解缓冲液进行冻融处理，其中先在-65。C下放置10分钟，再于65X:下放置10分钟 为一次冻融处理，再加入1.75 pl蛋白酶K (20 pg/Vl)于36i:下140转/分钟 震荡1小时进行保温消化；而后将保温消化的线虫溶液与等体积的氯仿和异戊醇 混合液轻轻混合于室温下，以12000转/分钟离心10分钟，提^/Jc相再加入水相 0.1^fr积的NaAc和0. 6倍体积异丙醇轻轻混合，于0。C静置2小时，再以于4 。C下14000转/分钟离心20分钟，沉淀即为壤线虫DNA。所述沉淀将离心管于室 温倒置，使沉淀自然干燥，将沉淀溶于50 ^tl TE溶液。-2(TC下保存备用。所述 TE溶液的成分和浓度为:10 mM Tris + 1 mM EDTA， pH 8. 0。
实施例2
与实施例l不同之处在于
土壤线虫的提取为将样品淘洗，分别经过60目和400目网筛，而后在样品中 加入过量的硫酸镁以2000转/分钟离心5分钟，将悬浮于硫酸镁溶液中的样品提 取出来。
将提取的土壤线虫悬液在65'C, 2-3分钟下温和热杀死，将温和热杀死的土 壤线虫悬液按照1: 4的比例浓缩而后加入其0. 4倡体积的细胞裂解缓冲液进行冻 融处理，再在每微升浓缩后土壤线虫悬液中加入20 pg的蛋白酶K于38X:下160 转/分钟震荡2小时进行保温消化;而后将保温消化的线虫溶液与等体积的氯仿和 异戊醇混合液混合于室温下，以12000转/分钟离心12分钟，提取水相再加入水 相0.H沐积的NaAc和0.6^沐积异丙醇混合，于(TC静置2. 5小时，再以于4 。C下15000转/分钟离心20分钟，沉淀即为土壤线虫DNA。所述加入蛋白酶K后 的终浓度为100 pg/ml。
实施例3
与实施例l不同之处在于
土壤线虫的提取为将样品淘洗，分别经过60目和40Q目网筛，而后在样品中 加入过量的硫酸镁以2000转/分钟离心5分钟，将悬浮于硫酸镁溶液中的样品提 取出来。将提取的土壤线虫悬液在63。C, 2-3分钟下温和热杀死，将温和热杀死的土 壤线虫悬液按照1: 4的比例浓缩而后加入其0. 4倍休积的细胞裂解缓冲液进行冻 融处理，再在每微升浓缩后土壤线虫悬液中加入20 pg的蛋白酶K于37'C下150 转/分钟震荡1.5小时进行保温消化;而后将保温消化的线虫溶液与等体积的氯仿
和异戊醇混合液混合于室温下，以12000转/分钟离心ii分钟，提m^相再加入
水相O. l倍体积的NaAc和0.6倍体积异丙醇混合，于(TC静置3小时，再以于4 'C下14500转/分钟离心20分钟，沉淀即为土壤线虫DNA。所述加入蛋白酶K后
的终浓度为100 Mg/ml。 应用例
取不同施肥处理(CK:不施肥；NP:单施化肥N+P; M:单施有机肥；MNP: 化肥与有机肥配施)土壤样品各200 g采用本发明的方法进行土壤线虫DNA提取, 即可得到不同施肥处理下的土壤线虫DNA。
利用Biophotometer (E卯endorf,德国)测定样品DNA含量(见表1 )，利 用琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量(参见图1 )。由表1和图1可知，DNA浓 度在CK处理下为15 jig/ml, NP处理下为20 pg/ml, M处理下为45 (ig/ml，應P 处理下为30(ig/ml。各处理下提取的DNA条带均较清晰，无杂带，表明其质量较 好；片段大小在18kb左右。
表1不同施肥处理下土壤线虫DNA浓度(单位lag/ml)
不同施肥处理不施肥单施化肥单施有机肥化肥与有机肥配施
(CK)(NP)(M)(MNP)
DNA浓度15204530
权利要求
1.一种土壤线虫DNA提取方法，其特征在于将提取的土壤线虫悬液在60-65℃，2-3分钟下温和热杀死，将温和热杀死的土壤线虫悬液浓缩后加入其0.4倍体积的细胞裂解缓冲液进行冻融处理，再在每微升浓缩后土壤线虫悬液中加入20μg的蛋白酶K于36-38℃下140-160转/分钟震荡1-2小时进行保温消化；而后将保温消化的线虫溶液与等体积的氯仿和异戊醇混合液混合于室温下，以12000转/分钟离心10-12分钟，提取水相再加入水相0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积异丙醇混合，于0℃静置2-3小时，再以于4℃下14000-15000转/分钟离心20分钟，沉淀即为土壤线虫DNA。
2. 按权利要求1所述的土壤线虫DNA提取方法，其特征在于所述土壤线虫 的提取为将样品淘洗，分别经过60目和400目网筛，而后在样品中加入过量的硫 酸镁以2000转/分钟离心4-5分钟，将悬浮于硫酸镁溶液中的样品提取出来。
3. 按权利要求1所述的土壤线虫DNA提取方法，其特征在于所述温和热杀 死的土壤线虫悬液按照1: 4的比例浓缩而后加入细胞裂解缓冲液;所述冻融处理 先将悬液在-65'C下放置10分钟，再于65'C下放置10分钟为一次冻融处理；所 述细胞裂解缓冲液于室温下保存，其组成为lOOmMTris、 100 mM EDTA和1. 5 M NaCl, pH 8.0;所述加入蛋白酶K后的终浓度为80-100 pg/ml。
4. 按权利要求1所述的土壤线虫DNA提取方法，其特征在于所述氯仿和异 戊醇混合液中氯仿与异戊醇体积比为24:1;所述NaAc浓度为3M,异丙醇为预冷 -20°C。
5. 按权利要求1所述的土壤线虫DNA提取方法，其特征在于所得土壤线虫 DNA自然干燥后将其溶于TE溶液于-2(TC下保存备用。
全文摘要
本发明涉及动物DNA提取，具体为一种土壤线虫DNA提取方法。采用淘洗-过筛-硫酸镁梯度离心方法将线虫从土壤样品中提取出来，用加热方法将其杀死，得到线虫悬液；然后，在线虫悬液中先加入细胞裂解缓冲液进行冻融处理，再加入蛋白酶进行保温消化；分别采用氯仿、异戊醇抽提DNA和NaAc、异丙醇沉淀DNA，室温下自然干燥，即可得到土壤线虫DNA。本发明采用物理、化学、酶法相结合方法对线虫细胞进行裂解，提高了线虫DNA提取率。成本较低廉，适于土壤线虫群落DNA的提取。
文档编号C12N15/10GK101580830SQ20081001141
公开日2009年11月18日 申请日期2008年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者张晓珂, 琪 李, 李风平, 梁文举 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所