一种土壤线虫分离提取的装置及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种土壤线虫分离和获取的装置及方法。
【背景技术】
[0002]土壤线虫作为自然界中仅次于昆虫的第二大无脊椎动物类群，由于其具有分布广泛、在食物链中占有关键位置、对环境的养分和干扰响应迅速、结构鉴定方法简单且结构与功能之间有着明显的相关性等特点，常被看作指示土壤健康的重要指标之一。从土壤中快速而全面地把线虫分离出来是研宄线虫的第一步，目前线虫学家一般用漏斗法、筛分淘洗法、离心浮选法以及浅盘法从土壤中分离线虫。
[0003]1、漏斗法和浅盘法
[0004]漏斗法是常用的一种方法，主要技术是在漏斗末端接一段橡皮管且橡皮管后端用弹簧夹夹紧。使用时，首先在漏斗内放置一层筛网，其上放置两层纱网和一层线虫滤纸。土样均匀铺在滤纸上后，加水至浸没土壤。分别在经过24、36、48h后，打开夹子，放出橡皮管内的水于小烧杯中。直接对获取的水进行计数和鉴别。该方法是利用线虫的趋水性和自身的重量，陆续脱离土壤。这种方法的优点是简单和便宜。缺点是获取的线虫局限于穿过滤纸孔隙进入水中即活动力强的线虫，在土壤样本多的情况下，由于线虫的活动性低会影响获取线虫的效率；另外，提取的时间一般为48小时。时间短难以捕捉移动慢的线虫；再者，如果操作不当，会引起线虫液混浊。
[0005]国内目前使用的浅盘法，即将10目的不锈钢筛盘放入配套的浅盘中，在筛盘上放置两层纱网和一层线虫滤纸。基本原理与漏斗法相近，只不过是土样摊铺在滤纸上的面积较大，有利于线虫的活动而已。
[0006]2、淘洗筛分法
[0007]淘洗筛分法主要是利用线虫与土壤成分之间大小差异以及比重的不同进行分离。该方法主要是将土壤中加水，悬液部分经过几次由粗到细的筛分后，大部分线虫停留在细筛上。这种方法不需要特殊设备，方法简单也不需要长时间的等待。近年来，学者围绕线虫从土壤颗粒的分离进行了许多改进，如注重分离泥沙的梯度沉淀等。但分离过程中，如果不仔细则会有许多线虫留在土壤中；另外筛分的线虫液液因含有一些泥沙而导致浑浊，影响对线虫的观察。
[0008]3、蔗糖溶液离心浮选法
[0009]离心浮选法主要依据是线虫的比重约为1.08g/m3,比水的比重略大，在土壤悬液中线虫与泥土层混在一起。如果用比重稍大的蔗糖溶液(1.18g/m3)，就可以把线虫从悬液中分开。主要步骤是将土样加水放在离心管内，离心几分钟后，弃去上清液。然后加入800g *L-1蔗糖溶液搅匀，再次离心几分钟，将上清液注进不同规格的筛子(300目、400目、500目)，并用水冲洗。获取筛网里的线虫后，进行计数和分类。这种方法相对简单而迅速。在操作过程中涉及的搅拌环节因离心管空间有限而会导致土壤不宜分散；另外在初次离心后的含有线虫的土壤颗粒非常紧实，会影响线虫从土壤中的进一步分离，尤其是质地粘重的土壤则更为严重。因此，此方法虽然快速，但由于土壤分散分离过程中，如果不仔细会有许多线虫留在土壤中，且筛分液容易浑浊，不利于线虫的观察。
[0010]为解决现有土壤线虫的蔗糖离心浮选法步骤繁琐的问题。有学者发明用高浓度氯化钾溶液浮选线虫。主要过程是将土壤加入氯化钾溶液中，搅拌后，再静置得上清液和沉淀物，然后将沉淀物代替土壤样品重复上述操作，将得到的上清液合并后注入网筛中，再用水反洗网筛即可。该方法避免了蔗糖提取过程中的离心程序，但仍需反复把土壤样品或沉淀物搅拌、静置。收集到的上清液用水反复冲洗网筛获取线虫。所得到的上清液浑浊，沉淀物的线虫收集不全等问题。
[0011]由于土壤线虫栖息在土壤粘粒之间形成的细小毛细管中，就有可能因为粘粒得不到充分分散而无法游离处理出来。所以目前众多的线虫提取方法中，有的未对土壤进行搅拌，有的主要用玻璃棒进行搅拌，这些都无法达到对土壤颗粒的充分分散。
[0012]另外，对土壤线虫从土壤中分离后，需要用显微镜进行观察，目前常用的就是含有线虫的水溶液。目前方法获得的线虫液大致有两种情况:一种是能获得较干净的线虫液，但在获得较干净的溶液中，沉淀物的转移过程中就有可能造成大量线虫被遗弃，严重影响研宄的效果。另一种情况就是虽然获得了完整数量的线虫液，但线虫液中会含有较多的土壤颗粒。这是相互矛盾的两方面。
[0013]总而言之，上述各方法存在的共性问题就是，一是不能从土壤中把线虫彻底地分离出来，二是不能把分离出来的线虫完全地收集起来。以上两方面都造成土壤线虫统计数量的不准确，会影响土壤研宄的准确性。
_4] 发明的内容
[0015]为了能够最大限度地把土壤中的线虫分离出来，且获得澄清的土壤线虫液，减少冲洗获取线虫的工作量，本发明提供一种方便、快捷和高效的土壤线虫分离提取的装及方法。利用该装置和相应的分离提取方法，可以尽大限度地把线虫从土壤中提取出来，确保提取数量的准确性，为土壤学研宄提供可信的保障。
[0016]本发明一方面提供一种土壤线虫分离提取装置，技术方案是:包括支架、盛土杯、搅拌器、分离筛、喷水系统、收集容器；所述盛土杯是一个底部起码具有一出液口的杯子，所述出液口上连接一导流管，导流管上设置一旋塞阀；所述搅拌器置于所述盛土杯中；所述分离筛包括第一级分离筛和第二级分离筛，第一级分离筛为水平或倾斜放置，第二级分离筛则为倾斜放置，在第二级分离筛的低端处设置有引液口 ；第一级分离筛为40目，第二级分离筛为400目；分离筛包括筛底和筛壁两部分，筛壁是沿筛底边缘自然向上衔接而成，筛底与筛壁衔接的地方形成圆弧形过渡；所述喷水系统包括喷水管，所述喷水管的出水沿筛壁向筛子的低端处冲刷。
[0017]优选地，所述盛土杯为一底部呈渐缩形的杯体，所述出液口设置于渐缩形的底部。
[0018]优选地，所述搅拌器包括旋转轴和搅拌轮，搅拌轮是由几片呈辐射状环周固定在旋转轴上的叶片组成，每片叶片与水平面成一定角度倾斜，每叶片的形状为平面体或螺旋状曲面体。
[0019]一种优选方案是:所述筛壁带有挡水板，所述挡水板是由筛壁沿着上沿水平向筛子内侧折，然后再竖直向下折而形成的，所述挡水板在筛子里侧形成一整圈；此时所述喷水管包括上部喷水管，所述上部喷水管成一整圈绑在所述挡水板与筛壁之间的区域内，所述上部喷水管上带有出水孔，出水沿着筛壁内侧向下流。
[0020]另一种优选方案是:所述筛壁带有挡水板，所述挡水板是由筛壁沿着上沿水平向筛子内侧折，然后再竖直向下折而形成的，所述挡水板在筛子里侧形成半圈；所述喷水管包括上部喷水管，所述上部喷水管对应的成半圈绑在所述挡水板与筛壁之间的区域内，所述上部喷水管上带有出水孔，出水沿着筛壁内侧向下流；所述挡水板和所述上部喷水管都位于倾斜的分离筛的高端位；所述喷水管还包括下部喷水管，所述下部喷水管成整圈绑在所述筛壁的底部，所述下部喷水管上带有出水孔，出水方向朝向筛子内侧。
[0021]进一步讲，所述上部喷水管绑在所述筛壁上，或绑在所述挡水板上。
[0022]所述喷水管内径为5mm，在管子上分散性的设置有若干个出水孔，管子上还开设有一个进水口，所述进水口位于倾斜的筛子的最上端，所述进水口外连加水设备。
[0023]所述上部喷水管捆绑在距离筛壁上沿往下Icm处，且此处高度小于所述挡水板的高度；所述下部喷水管捆绑在距离筛底往上Icm处。
[0024]所述第一级分离筛和第二级分离筛都为倾斜放置的情况下，倾斜方向相反，且所述第二级分离筛倾斜角度大于所述第一级分离筛。
[0025]本发明另一方面提供一种土壤线虫分离提取的方法，包括如下步骤:
[0026]I)首先对供试鲜土进行简单处理，移出肉眼可见的杂物；
[0027]2)称取10g的供试鲜土放入到盛土杯中，加入400ml的蒸馏水或自来水，启动搅拌器，以50?100转/分钟的速度，搅拌5分钟；
[0028]3)打开盛土杯上的旋塞阀，打开筛子下面的收集管，使盛土杯中的土液流出，穿越下面的第一级分离筛和第二级分离筛，从收集管流出，进入收集容器；<