基于未变性染色皮粉底物的蛋白酶胶原蛋白水解活力测定方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白酶活力测定领域，涉及基于未变性染色皮粉底物的蛋白酶胶原蛋 白水解活力测定方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 胶原蛋白是构成动物皮的主要结构蛋白，胶原蛋白的结构由三条α肽链缠绕成 特有的三股螺旋，多肽链序列是由Gly-x-y序列重复而成的，Gly残基沿三股螺旋的中心轴 堆积，一股链上的Gly与第二股的X残基和第三股的y残基相邻，每个Gly残基的N-H与相 邻链的X残基的C = 0形成氢键，且由于Hyp残基的羟基也参与链间氢键的形成，三股螺旋 得到进一步稳定和增强，由于以上特点，胶原蛋白不易被一般的蛋白酶水解，但能被具有胶 原蛋白酶活力的酶降解。
[0003] 蛋白酶越来越多地被应用于食品、医药以及制革等行业中。在食品工业，水解动物 皮可得到胶原多肽，该水解产物具有良好的营养功能、理化性能及生理功能；在医药工业， 由皮胶原得到的水解胶原蛋白能有效促进创伤皮肤的愈合、提高骨骼强度、抑制血压上升 等；在制革工业，胶原蛋白酶广泛地用于浸水、脱毛、软化等工序中。因此，建立蛋白酶胶原 蛋白水解活力检测方法，有利于了解胶原蛋白水解酶的性能，并根据其性能合理地应用。
[0004] 蛋白酶活力的测定方法有以溶解的酪素作为底物的LVU法、胰蛋白酶的转化倍数 法、福林法，以变性的血清蛋白为底物的Anson法，以琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-亮 氨酰-对硝基苯胺（Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA)为底物的蛋白酶活力测定方法。但由于酪 素、变性血清蛋白、Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA底物与胶原蛋白的性质相差较大，因而以上 方法测得的蛋白酶活力对蛋白酶在对胶原处理等方面的应用中并无实际指导意义。氨基酸 含量分析法则是根据羟脯氨酸是胶原蛋白特有的氨基酸这一原理，通过测定蛋白酶对胶原 蛋白作用后所得水解物中的羟脯氨酸含量来计算蛋白酶的胶原蛋白水解活力，虽然该方法 能克服底物差异性，但存在着测定过程麻烦、测得周期较长的不足。
[0005] 对于蛋白酶的胶原蛋白水解活力的测定，还可采用染色皮粉作为底物，该底物在 蛋白酶的催化作用下水解，释放出来的酶解产物带有染料分子，使水解液具有颜色而易于 检测，如Azocoll、Congo red和以及Commassie Brilliant Blue等染料染色皮粉被用作底 物来测定蛋白酶的活力。但这些染料主要是含有磺酸基和羧基等亲水基团的酸性或直接性 染料，它们主要是通过染料分子上的磺酸基、羧基与胶原蛋白以范德华力和氢键相结合，这 种结合力较弱，在酸性或碱性条件下，染色皮粉底物上的染料分子易脱落或染料的颜色容 易发生较大的变化，导致染色皮粉底物水解液的光吸收特征不稳定，因而该方法通常只适 合在中性条件下测定蛋白酶的活力，不适合在广谱的pH值条件下对蛋白酶活力进行测定。 由于蛋白酶的种类较多，根据蛋白酶的最适作用PH值，蛋白酶可分为酸性、中性和碱性蛋 白酶，该方法难以准确测定酸性和碱性蛋白酶的胶原蛋白水解活力，导致其应用受到了很 大的限制。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于未变性染色皮粉底物的蛋 白酶胶原蛋白水解活力测定方法，以拓宽现有基于染色皮粉底物的蛋白酶活力测定方法的 pH值适用范围。
[0007] 可实现上述发明目的的基于未变性染色皮粉底物的蛋白酶胶原蛋白水解活力测 定方法，包括以下步骤：
[0008] (1)制备染色皮粉：将由动物皮中间网状层制取的皮粉分散在浓度为0. 005~ 0. 2g/mL的NaCl溶液中形成皮粉浓度为0. 05~0. lg/mL的悬浮液，于10~45°C振荡使皮 粉中的杂质充分进入液相，然后按照每质量份皮粉使用〇. 15~4. 0质量份低温活性染料、 0. 05~1. 2质量份固色剂的量，加入低温活性染料溶液，于10~45°C振荡使低温活性染料 与皮粉中的胶原蛋白发生共价结合，再加入固色剂溶液，于10~45°C充分振荡后过滤，向 所得固相皮粉中加入NH 4Cl溶液至液相呈中性，之后经过滤所得皮粉用水洗涤至洗出液呈 无色，洗涤后的皮粉再经脱水、干燥、粉碎制得染色皮粉；
[0009] (2)测定染色皮粉标准曲线：称取若干不同质量份的染色皮粉，分别向各染色皮 粉中加入等量的缓冲液以及等量的蛋白酶溶液，于20~50°C振荡至各染色皮粉完全水解， 得到染色皮粉水解产物的浓度呈梯度变化的若干份水解液，以检测波长测定各份水解液的 吸光度值，以染色皮粉的浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线；
[0010] (3)制备待测反应液和空白对照液
[0011] 向0· 5~50mg染色皮中加入1~20mL缓冲液，加热至测定温度，加入将蛋白酶用 水稀释N倍形成的蛋白酶溶液0. 1~5mL，在振荡下于测定温度进行酶解反应T min，控制 酶解反应的时间使染色皮粉不被完全消耗，酶解反应后立即离心，所得上清液即为待测反 应液；
[0012] 向0. 5~50mg染色皮粉中加入1~20mL缓冲液，加热至测定温度，于测定温度振 荡T min，加入将蛋白酶用水稀释N倍形成的蛋白酶溶液0. 1~5mL，立即离心，所得上清液 即为空白对照液；
[0013] ⑷测得吸光度值并计算酶活力：取空白对照液和待测反应液在检测波长下测定 吸光度值，分别记作A。和A，根据式（1)计算计蛋白酶的胶原蛋白水解活力，
[0014] (1)
[0015] 式⑴中，U为蛋白酶的胶原蛋白水解活力，A。和A分别为空白对照液和待测反应 液的吸光度值，V 1为酶解反应后反应体系的总体积，mL，V 2为稀释N倍的蛋白酶溶液的加入 量，mL，T为酶解反应的时间，min，K为标准曲线的斜率，N为蛋白酶的稀释倍数。
[0016] 上述技术方案中，所述低温活性染料为X型活性染料，优先采用活性艳蓝X-BRdg 性艳红X-3B、活性嫩黄X-7R或者活性艳橙X-GN。
[0017] 上述技术方案中，所述蛋白酶为酸性蛋白酶、中性蛋白酶或者碱性蛋白酶。
[0018] 上述技术方案中，所述固色剂为Na2C03、Na 2HC03、NaOH、代碱剂中的至少一种。
[0019] 上述技术方案中，所述低温活性染料的浓度为0. 015~0. 2g/mL，固色剂溶液的浓 度为 0.0 l ~0. 2g/mL。
[0020] 上述技术方案中，所述缓冲液的pH值为1~14,优先采用伯瑞坦-罗宾森缓冲液、 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液或者Tris-HCl缓冲液。
[0021] 上述技术方案中，所述检测波长的确定方法为：向染色皮粉中加缓冲液和蛋白酶 溶液，于20~50°C振荡至染色皮粉完全水解，将得到的染色皮粉的水解液用缓冲液稀释并 测定其在400~SOOnm波长范围内的光吸收曲线，以最大吸收波长作为检测波长。
[0022] 上述技术方案中，步骤（1)所述由动物皮中间网状层制取的皮粉和染色皮粉为过 40~200目筛的皮粉。
[0023] 上述技术方案中，用于制备染色皮粉的动物皮优选为牛皮、猪皮或羊皮。
[0024] 上述技术方案中，步骤（1)在加入固色剂溶液后，优选在10~45°C振荡30~ 60min〇
[0025] 上述技术方案中，酶活力定义为：在测定温度和pH值条件下，每分钟催化1 μ g的 染色皮粉水解成溶液所需蛋白酶的量为一个活力单位。
[0026] 本发明还提供了一种上述方法的应用，上述方法适用于在制革、食品或者医药领 域中测定蛋白酶或蛋白酶制剂的胶原蛋白水解活力。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0028] 1.本发明提供了一种测定蛋白酶胶原蛋白水解活力的新方法，该方法采用低温活 性染料对皮粉进行染色，皮粉中的胶原蛋白与低温活性染料之间形成了共价结合，由于共 价结合的形式比氢键、范德华力等形式的结合更加牢固，因此染色皮粉中的染料分子即使 在酸性和碱性条件下也不容易脱落，加之染料的光吸收特性在酸碱度不同的情况下均无明 显变化，因而本发明所述方法适用于在较宽的PH值条件下测定酶活力，对酸性、中性和碱 性蛋白酶均使用。
[0029] 2.由于本发明所述方法采用低温活性染料在10~45°C对皮粉进行染色，在该温 度染色能避免皮粉发生热变性，以未变性的染色皮粉作为底物测定蛋白酶的胶原蛋白水解 活力，反应体系接近实际应用，因