一种提高嗜冷菌蛋白酶产量的培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种培养基，其包括碳源80～120g/L，氮源12～20g/L，无机盐2.0～3.0g/L，固体表面活性剂0.2～0.6g/L或液体表面活性剂0.2～1.0mL/L，以及，使各成分形成对应浓度的水。本发明培养基为一种高产蛋白酶培养基，采用本发明的产酶培养基培养嗜冷菌，其所产蛋白酶的含量远高于现有技术，这为后续研究原料乳等待测物中的胞外蛋白酶的酶活和嗜冷菌数之间的关系提供了基础。本发明为食品安全检测【技术领域】提供了一种简单快速灵敏的嗜冷菌蛋白酶产酶培养基，对我国的食品安全具有较大意义。
【专利说明】一种提高嗜冷菌蛋白酶产量的培养基
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种培养基，具体涉及一种提高嗜冷菌蛋白酶产量的培养基。
【背景技术】
[0002]嗜冷微生物(Psychrophilic microorganism)是指在低温环境中能够正常生长繁殖的微生物。Forster于1887年发现了能够在冰点温度下生长繁殖的微生物，这也是生物界首次发现低温生长的微生物。此后的研究中，科学家从自然界的生物中分离出了不同种类的嗜冷微生物。Hucker根据生长温度将嗜冷菌进行了细分，将能够在0°C时生长繁殖，在15°C以下生长旺盛，最高生长温度不超过20°C的微生物定义为专性嗜冷菌(Psychrotrophile);将在低于5°C的条件下能够生长,最高生长温度在20°C以上的嗜冷微生物定义为兼性嗜冷菌(Psychrotroph)。这种分类方法已被生物界广泛认可。
[0003]目前，对于牛乳中的嗜冷菌，已经有一些较为先进的快速检测方法，如直接荧光过滤法，电阻抗法，PCR法，流动血细胞法，酶联免疫吸附技术等，但这些方法往往成本过高，不适合我国国情。此外，也有一些研究表明，牛乳中的嗜冷菌数量和原料乳整体的蛋白酶活性之间存在一定的关系 ，通过对原料乳中酶活性的检测以及酶活性和菌数之间建立的关系可以达到快速检测原料乳中嗜冷菌数的目的，这为从酶活角度出发建立嗜冷菌的快速检测方法提供了理论依据。
[0004]然而，由于原料乳中嗜冷菌分泌的蛋白酶含量很低，自然其活力也不高，因而限制了检测的精确度。而培养基的组分构成是影响嗜冷菌发酵水平的关键因素，若能够提高培养基中整体的蛋白酶活力 ，则对研究从酶活角度出发建立嗜冷菌的快速检测方法大有助益，因此，有必要研究开发新的培养基，即提高嗜冷菌蛋白酶产量的培养基。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是为了提高嗜冷菌蛋白酶的产量，以满足后续研究原料乳中嗜冷菌数量和产酶活性之间的关系，而提供一种新的能够提高嗜冷菌蛋白酶产量的
培养基。
[0006]本发明的发明人发现，目前已经有关于嗜冷菌分泌的胞外脂肪酶的酶活和嗜冷菌数之间关系的相关研究，如《食品科学》2006年27期《原料乳中嗜冷菌计数及产脂肪酶特性的研究》，这也为建立胞外蛋白酶的酶活和嗜冷菌数之间关系的研究提供了有益借鉴。鉴于目前嗜冷菌在普通培养基中的蛋白酶产量很低的现状，为了开展前述研究，首先就需要提高培养基中蛋白酶的产量。
[0007]通常情况下，用于培养微生物的培养基都包括碳源、氮源、无机盐和表面活性剂等成分，但是这些组分的物质选择种类非常之多，组分构成的变化会带来技术效果的巨大差异。为了提高嗜冷菌蛋白酶的产量，本发明的发明人作了大量的研究工作，并发现了一些特殊种类和含量配比的碳氮源及其他相应组分配合而制得的培养基能有助于提高嗜冷菌的蛋白酶产量。在此基础上，本发明提供下述技术方案。[0008]本发明提供的技术方案之一是:
[0009]一种提高嗜冷菌蛋白酶产量的培养基，其包括如下组分:碳源80~120g/L，氮源12~20g/L，无机盐2.0~3.0g/L,固体表面活性剂0.2~0.6g/L或液体表面活性剂0.2~
1.0mL/L,以及，使各成分形成对应浓度的水；所述的碳源选自蔗糖、乳糖、淀粉、麦芽糖和葡萄糖中的一种或多种，所述的氮源选自大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸出粉、尿素和干酪素中的一种或多种，所述无机盐选自KH2P04、MgS04和CaCl2中的一种或多种，所述固体表面活性剂为十二烷基磺酸钠，所述液体表面活性剂选自吐温-20、吐温-60和吐温-80中的一种或多种。
[0010]本发明中，所述的碳源优选为蔗糖、乳糖和葡萄糖的组合；所述的氮源优选为胰蛋白胨、酵母浸出粉和干酪素的组合；所述的液体表面活性剂优选为吐温-80 ;所述无机盐优选为KH2P04、MgSO4和CaCl2的组合。
[0011]本发明人经过大量的实验发现，当需要取得更佳的技术效果时，本发明的培养基较佳地包括如下组分:鹿糖35~45g/L, a -乳糖35~45g/L,葡萄糖8~12g/L,酵母浸出粉5~9g/L，干酪素4~6g/L，胰蛋白胨2~4g/L，吐温-800.2~0.8mL/L, KH2PO4L 5~
2.5g/L，MgSO4 ? 7H200.4~0.6g/L，CaCl20.15~0.25g/L，以及，使各成分形成对应浓度的蒸馏水。
[0012]本发明的一较佳实例为:所述的培养基包括如下组分:蔗糖35g/L，a-乳糖45g/L,葡萄糖8g/L,酵母浸出粉5g/L,干酪素6g/L,胰蛋白胨2g/L,吐温-80 0.2mL/L,KH2PO4L 5g/L，MgSO4 ? 7H200.6g/L，CaCl20.25g/L，以及，使各成分形成对应浓度的蒸馏水。
[0013]本发明的另一较佳实`例为:所述的培养基包括如下组分:蔗糖45g/L，a-乳糖35g/L,葡萄糖12g/L,酵母浸出粉9g/L,干酪素4g/L,胰蛋白胨4g/L,吐温-80 0.8mL/L,KH2P042.5g/L，MgSO4 ? 7H200.4g/L，CaCl20.15g/L，以及，使各成分形成对应浓度的蒸馏水。
[0014]本发明的又一较佳实例为:所述的培养基包括如下组分:蔗糖38g/L，a-乳糖37g/L，葡萄糖10g/L，酵母浸出粉8g/L，干酪素5g/L，胰蛋白胨2g/L，吐温-80 0.5mL/L,KH2P042g/L, MgSO4 ? 7H200.5g/L，CaCl20.25g/L，以及，使各成分形成对应浓度的蒸馏水。
[0015]本发明的再一较佳实例为:所述的培养基包括如下组分:蔗糖42g/L，a-乳糖38g/L,葡萄糖10g/L,酵母浸出粉7g/L,干酪素5g/L,胰蛋白胨3g/L,吐温-80 0.6mL/L,KH2P042g/L, MgSO4 ? 7H200.4g/L，CaCl20.25g/L，以及，使各成分形成对应浓度的蒸馏水。
[0016]本发明的培养基最优选包括如下组分:蔗糖40g/L，a-乳糖40g/L，葡萄糖10g/L，酵母浸出粉 7g/L，干酪素 5g/L，胰蛋白胨 3g/L，吐温-80 0.5mL/L, KH2P042g/L,MgSO4 ? 7H200.5g/L，CaCl20.2g/L，以及，使各成分形成对应浓度的蒸馏水。
[0017]本发明的培养基用于培养嗜冷菌，能够提高其蛋白酶产量，便于需要以酶为载体进行的相关研究，如通过研究体系中整体酶活力和菌数之间的关系用以检测体系中的菌含
且雄里寺。
[0018]本发明提供的技术方案之二是:前述培养基的制备方法。
[0019]前述培养基通过常规的制备方法制备即可，如将各组分先以水溶解后定容至各组分所需的浓度，再进行高温灭菌即可。
[0020]所述的制备方法较佳的是将各组分先以蒸馏水溶解到所需浓度，再将pH调节至
6.9~7.1，然后在110~120°C下灭菌5~20分钟即可。[0021]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0022]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0023]本发明的积极进步效果在于:本发明培养基为一种高产蛋白酶培养基，采用本发明的产酶培养基培养嗜冷菌，其所产蛋白酶的含量远高于现有技术，这为后续研究原料乳等待测物中的胞外蛋白酶的酶活和嗜冷菌数之间的关系提供了基础。本发明为食品安全检测【技术领域】提供了一种简单快速灵敏的嗜冷菌蛋白酶产酶培养基，对我国的食品安全具有较大意义。
【具体实施方式】
[0024]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0025]实施例1培养基的制备
[0026]按照蔗糖40g/L，α -乳糖40g/L，葡萄糖10g/L，酵母浸出粉7g/L，干酪素5g/L，胰蛋白胨 3g/L,吐温-80 0.5mL/L, KH2P042g/L, MgSO4.7Η200.5g/L，CaCl20.2g/L 的配方称取各组分。以蒸馏水溶解上述各组分，调节PH至7.0，在灭菌锅115°C下灭菌10分钟，即得所
述培养基。
[0027]实施例2培养基的制备
[0028]按照蔗糖20g/L，α -乳糖30g/L，葡萄糖30g/L，酵母浸出粉5g/L，干酪素5g/L，胰蛋白胨 5g/L,吐温-80 0.5mL/L, KH2P042g/L, MgSO4.7Η200.5g/L，CaCl20.2g/L 的配方称取各组分。以蒸馏水溶解上述各组分，调节PH至7.1，在灭菌锅110°C下灭菌20分钟，即得所
述培养基。
[0029]实施例3培养基的制备
[0030]按照蔗糖30g/L，α -乳糖20g/L，葡萄糖20g/L，酵母浸出粉7g/L，干酪素7g/L，胰蛋白胨 9g/L，吐温-80 1.5mL/L, KH2P042g/L, MgSO4.7Η200.5g/L，CaCl20.2g/L 的配方称取各组分。以蒸馏水溶解上述各组分，调节PH至7.1，在灭菌锅110°C下灭菌20分钟，即得所
述培养基。
[0031]实施例4培养基的制备
[0032]按照蔗糖30g/L，α -乳糖20g/L，葡萄糖30g/L，酵母浸出粉9g/L，干酪素5g/L，胰蛋白胨 9g/L，吐温-80 lmL/L, KH2P042g/L, MgSO4.7H200.5g/L，CaCl20.2g/L 的配方称取各组分。以蒸馏水溶解上述各组分，调节PH至7.1，在灭菌锅110°C下灭菌20分钟，即得所述
培养基。
[0033]实施例5培养基的制备
[0034]按照蔗糖40g/L，α -乳糖20g/L，葡萄糖40g/L，酵母浸出粉7g/L，干酪素9g/L，胰蛋白胨 5g/L，吐温-80 lmL/L, KH2P042g/L, MgSO4.7H200.5g/L，CaCl20.2g/L 的配方称取各组分。以蒸馏水溶解 上述各组分，调节PH至7.1，在灭菌锅110°C下灭菌20分钟，即得所述
培养基。
[0035]实施例6培养基的制备[0036]按照蔗糖30g/L，α -乳糖40g/L，葡萄糖20g/L，酵母浸出粉7g/L，干酪素9g/L，胰蛋白胨 7g/L,吐温-80 0.5mL/L, KH2P042g/L, MgSO4.7Η200.5g/L，CaCl20.2g/L 的配方称取各组分。以蒸馏水溶解上述各组分，调节PH至7.1，在灭菌锅110°C下灭菌20分钟，即得所
述培养基。
[0037]实施例7培养基的制备
[0038]按照蔗糖35g/L，α -乳糖45g/L，葡萄糖8g/L，酵母浸出粉5g/L，干酪素6g/L，胰蛋白胨 2g/L，吐温-80 0.2mL/L，KH2PO4L 5g/L，MgSO4.7H200.6g/L，CaCl20.25g/L 的配方称取各组分。以蒸馏水溶解上述各组分，调节PH至7.0，在灭菌锅115°C下灭菌10分钟，即得所述培养基。
[0039]实施例8培养基的制备
[0040]按照蔗糖45g/L，α -乳糖35g/L，葡萄糖12g/L，酵母浸出粉9g/L，干酪素4g/L，胰蛋白胨 4g/L，吐温-80 0.8mL/L, KH2P042.5g/L，MgSO4.7H200.4g/L，CaCl20.15g/L 的配方称取各组分。以蒸馏水溶解上述各组分，调节PH至6.9，在灭菌锅120°C下灭菌10分钟，即得
所述培养基。
[0041 ] 实施例9培养基的制备
[0042]按照蔗糖38g/L，α -乳糖37g/L，葡萄糖10g/L，酵母浸出粉8g/L，干酪素5g/L，胰蛋白胨 2g/L，吐温-80 0.5mL/L，KH2P042g/L，MgSO4.7H200.5g/L，CaCl20.25g/L 的配方称取各组分。以蒸馏水溶解上述各组分，调节pH至7.0，在灭菌锅120°C下灭菌5分钟，即得所
述培养基。
[0043]实施例10培养基的制备
[0044]按照蔗糖42g/L，α -乳糖38g/L，葡萄糖10g/L，酵母浸出粉7g/L，干酪素5g/L，胰蛋白胨 3g/L，吐温-80 0.6mL/L，KH2P042g/L，MgSO4.7H200.4g/L，CaCl20.25g/L 的配方称取各组分。以蒸馏水溶解上述各组分，调节PH至7.1，在灭菌锅110°C下灭菌20分钟，即得所
述培养基。
[0045]效果实施例1蛋白酶活的检测
[0046]使用实施例1制得的培养基，发酵嗜冷菌Pseudomonas fluorescens(ATCC13525)。
[0047]培养方法:发酵时间为30小时，接种量5% (v/v)，为5mL，28°C摇床，180rpm培养，通过福林-酚法检验得到蛋白酶的发酵水平为42.5510U/mL。
[0048]福林-酚法步骤如下:
[0049](I)配置 O μ g/mL, 20 μ g/mL, 40 μ g/mL, 60 μ g/mL, 80 μ g/mL, 100 μ g/mL 的酪氨酸溶液，编号I~6号,各加入0.4mol碳酸钠5mL,再加入一倍稀释后的福林试剂ImL, 40°C水浴20min，在M5酶标仪上测定OD值，波长660nm，将2~6号测定值减去I号测定值(空白值)即为净OD值。以净OD值为横坐标，酪氨酸浓度为纵坐标，绘制标准曲线。其中，福林试剂通过如下方法制得:于2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO4.2H20) 100g，钥酸钠(NaMoO4.2Η20)258，水700ml，85%的磷酸50ml，浓盐酸100ml，文火回流10h，加入硫酸锂(Li2S04) 150g，蒸馏水50ml，混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴，再蒸沸15min，以驱逐残留的溴及除去颜色，溶液应呈黄色。若溶液有绿色，需再加数滴液溴，再蒸沸除去，冷却后定容至lOOOmL，即制得。[0050](2)取发酵液11111^401€水浴2111；[11,加入已预热的酪蛋白ImL,保温IOmin后加入
0.4mol三氯乙酸,继续保温20min后5000rpm离心IOmin,将滤液取ImL转移至新的试管中，加入0.4mol碳酸钠5mL，一倍稀释后的福林试剂lmL，40°C保温20min后，在M5酶标仪上测定OD值,波长660nm。
[0051](3)空白试验测定方法同上，唯有加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。
[0052](4)测定的数值通过标准曲线求得蛋白酶活力，公式如下:
[0053]样品蛋白酶活力单位=A/10X4XNX1/ (1-ff)
[0054]式中:A为由样品测得的OD值，查标准曲线得到的相应的酪氨酸微克数；4指4毫升反应液取出ImL测定；N为酶液稀释的倍数；10指反应10min ；ff为样品水分百分含量。
[0055]效果实施例2~6蛋白酶活的检测
[0056]使用实施例2~6制得的培养基，发酵ATCC13525菌株，其中，发酵培养的方法和条件，以及蛋白酶活的检测方法均同效果实施例1。测得的结果如下表所示:
[0057]
【权利要求】
1.一种提高嗜冷菌蛋白酶产量的培养基，其特征在于，其包括如下组分:碳源80~120g/L，氮源12~20g/L，无机盐2.0~3.0g/L,固体表面活性剂0.2~0.6g/L或液体表面活性剂0.2~1.0mL/L，以及，使各成分形成对应浓度的水；所述的碳源选自蔗糖、乳糖、淀粉、麦芽糖和葡萄糖中的一种或多种，所述的氮源选自大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸出粉、尿素和干酪素中的一种或多种，所述无机盐选自1012?04、]\%504和CaCl2中的一种或多种，所述固体表面活性剂为十二烷基磺酸钠，所述液体表面活性剂选自吐温-20、吐温-60和吐温-80中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的碳源为蔗糖、乳糖和葡萄糖的组合；所述的氮源为胰蛋白胨、酵母浸出粉和干酪素的组合；所述的液体表面活性剂为吐温-80 ;所述无机盐为KH2P04、MgSO4和CaCl2的组合。
3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，其包括如下组分:蔗糖35~45g/L，α-乳糖35~45g/L,葡萄糖8~12g/L,酵母浸出粉5~9g/L,干酪素4~6g/L,胰蛋白胨2~4g/L,吐温-80 0.2 ~0.8mL/L, KH2PO4L 5 ~2.5g/L, MgSO4.7Η200.4 ~0.6g/L, CaCl20.15 ~0.25g/L，以及，使各成分形成对应浓度的蒸馏水。
4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，其包括如下组分:蔗糖35g/L，α-乳糖45g/L,葡萄糖8g/L,酵母浸出粉5g/L,干酪素6g/L,胰蛋白胨2g/L,吐温-80 0.2mL/L,KH2PO4L 5g/L，MgSO4.7H200.6g/L，CaCl20.25g/L，以及，使各成分形成对应浓度的蒸馏水。
5.如权利要求1所述的 培养基，其特征在于，其包括如下组分:蔗糖45g/L，α-乳糖35g/L,葡萄糖12g/L,酵母浸出粉9g/L,干酪素4g/L,胰蛋白胨4g/L,吐温-80 0.8mL/L,KH2P042.5g/L，MgSO4.7H200.4g/L，CaCl20.15g/L，以及，使各成分形成对应浓度的蒸馏水。
6.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，其包括如下组分:蔗糖38g/L，α-乳糖37g/L，葡萄糖10g/L，酵母浸出粉8g/L，干酪素5g/L，胰蛋白胨2g/L，吐温-80 0.5mL/L,KH2P042g/L, MgSO4.7H200.5g/L，CaCl20.25g/L，以及，使各成分形成对应浓度的蒸馏水。
7.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，其包括如下组分:蔗糖42g/L，α-乳糖38g/L,葡萄糖10g/L,酵母浸出粉7g/L,干酪素5g/L,胰蛋白胨3g/L,吐温-80 0.6mL/L,KH2P042g/L, MgSO4.7H200.4g/L，CaCl20.25g/L，以及，使各成分形成对应浓度的蒸馏水。
8.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，其包括如下组分:蔗糖40g/L，α-乳糖40g/L,葡萄糖10g/L,酵母浸出粉7g/L,干酪素5g/L,胰蛋白胨3g/L,吐温-80 0.5mL/L,KH2P042g/L, MgSO4.7H200.5g/L，CaCl20.2g/L，以及，使各成分形成对应浓度的蒸馏水。
9.如权利要求1~8任一项所述的提高嗜冷菌蛋白酶产量的培养基的制备方法，其特征在于，将各组分先以水溶解后定容至各组分所需的浓度，再进行高温灭菌即可。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法是将各组分先以蒸馏水溶解到所需浓度，再将pH调节至6.9~7.1，然后在110~120°C下灭菌5~20分钟即可。
【文档编号】C12R1/39GK103695403SQ201310753761
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】任婧, 张阳旸, 陈万义, 刘振民 申请人:光明乳业股份有限公司