一种可用于临床治疗的人膝关节软骨细胞体外扩增方法
【专利摘要】本发明公开了一种可供临床使用的人膝关节软骨细胞体外扩增方法，包括以下步骤：对患者的离体软骨进行分离提取，获得软骨细胞；将所述软骨细胞接种至培养基中进行细胞原代培养；待所述细胞原代培养中的所述软骨细胞的汇合度为70～80%时进行细胞传代培养;其中，所述细胞原代培养和所述细胞传代培养的培养基均含有体积分数5～20%的患者离体血清、20～40ng/mlFGF和20～40ng/mlPDGF。上述方法安全可靠，培养获得的软骨细胞适于临床使用。
【专利说明】一种可用于临床治疗的人膝关节软骨细胞体外扩增方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医疗领域的细胞体外培养技术，适用于骨科对关节软骨缺损的治疗，特别涉及一种可供临床使用的人膝关节软骨细胞体外扩增方法。
【背景技术】
[0002]软骨细胞是关节软骨内唯一的细胞类型，是终末细胞，在关节滑膜液的内环境下缺乏增殖能力，加上关节软骨没有血液供应，一旦破坏，缺乏再生修复能力。目前，治疗人体软骨疾病的方法，包括将从自体其他部位采集软骨组织移植到缺损部位进行治疗的方法，该方法存在采集部位选择和采集量有限的问题，不能有效适用。为此，本领域技术人员进行新的构思，希望通过采集少量软骨，进行体外分离、培养扩增软骨细胞后，再将软骨细胞回植到患处关节的方式来实现软骨的修复。
[0003]但是，现有的细胞培养扩增方法是通过含动物源性血清的培养基进行软骨细胞的体外扩增，由于异种蛋白可能引发免疫排斥反应，所以不能应用于临床，若从患者近亲取血清，又需血型配对，会增加患者的经济负担。而且现有的软骨细胞培养基和生长因子的内毒素含量高于0.5EU/ml，严重影响了软骨细胞的增殖和生长速度。再者，现有的软骨细胞培养方法，虽能在最大程度上避免细菌和真菌污染，但杜绝不了支原体(支原体直径在
0.2-2 μ m，可以轻松地通过滤膜，混入培养系统)的污染，导致软骨细胞缺乏安全性，这进一步阻碍了软骨细胞的临床应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种可供临床使用的人膝关节软骨细胞体外扩增方法，以解决现有技术中体外软骨细胞不能适用于临床，且体外软骨细胞扩增速度较慢、缺乏安全性的技术问题。`
[0005]为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下:
[0006]一种可供临床使用的人膝关节软骨细胞体外扩增方法，包括以下步骤:
[0007]对患者的离体软骨进行分离提取，获得软骨细胞；
[0008]将所述软骨细胞接种至培养基中进行细胞原代培养；
[0009]待所述细胞原代培养中的所述软骨细胞的汇合度为70~80%时进行细胞传代培养；
[0010]其中，所述细胞原代培养和所述细胞传代培养的培养基均含有体积分数5~20%的患者离体血清、20~40ng/mlFGF和20~40ng/mlPDGF。
[0011 ] 上述人膝关节软骨细胞体外扩增方法所采用的离体软骨来源于患者自身的非负重区软骨，这样不会影响患者的运动功能，且与传统移植方法相比，效果显著并减少了患者痛苦，一般的临床医生均能够单独操作。所述细胞培养基不添加任何动物血清，而利用生长因子和少量的患者自身血清作为细胞营养添加物，有效地避免了异种病毒的传染，减小了细胞移植的风险，提高了细胞移植的安全性，而且避免了免疫排斥和伦理问题。通过生长因子的生物学诱导效应，刺激软骨细胞增殖，达到软骨细胞的数量级扩增，解决了细胞数量问题。扩增培养获得的软骨细胞能够适用于临床使用，将其移植到软骨缺损部位后，可以分泌大量的细胞外基质，从而促使缺损部位再生，治疗效果显著。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中:
[0013]图1为细胞汇合度达70~80%时的软骨细胞10倍放大图；
[0014]图2为细胞汇合度达70~80%时的软骨细胞20倍放大图。
【具体实施方式】
[0015]为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例与附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0016]本发明实施例提供一种可供临床使用的人膝关节软骨细胞体外扩增方法，包括以下步骤:
[0017]S01、对患者的离体软骨进行分离提取，获得软骨细胞；
[0018]S02、将所述软骨细胞接种至培养基中进行细胞原代培养；待所述细胞原代培养中的所述软骨细胞的汇合度为70~80%时进行细胞传代培养；
[0019]具体地，上述SOl步骤中，所述离体软骨来源于患者自体软骨，优选采集患者自身的非负重区软骨100~200mg即可，这样既能满足细胞扩增的需要，又能在减少患者痛苦的条件下实现软骨的修复和治疗。进一步地，优选在所述分离提取的步骤之前，将所述离体软骨切成0.8~1.2mm3大小的软骨组织块，以便于消化处理，然后将切好的软骨组织块进行消化处理12~16小时，制得单个形式的悬浮软骨细胞，这样可以使得后续的分离有效进行。而且在所述消化处理步骤中，所使用的消化介质优选包括I~2mg/ml的II型胶原酶，消化处理的温度优选为37°C。具体可以这样操作:以第一培养介质冲洗所述软骨组织块3次后，放入8~IOmL第二培养介质(即消化介质)中于37°C条件下进行消化，最后利用40微米的细胞滤器制成单个的悬浮细胞。其中，第一培养介质为Ham’ sF12介质,包括IOmmol/LHEPES缓冲液、70 μ mol/L硫酸庆大霉素、22 μ mo I/L 二性霉素B、300 μ mol/L抗坏血酸。第二培养介质含有I~2mg/ml的II型胶原酶。在所述分离提取步骤中，采用离心分离，离心速度优选为1200~1500转/分，弃上清液后收集细胞沉淀，这样可以有效分离出所需的软骨细胞。在采集的软骨量为100~200mg时，一般可以得到I~2X IO5个软骨细胞。
[0020]上述S02步骤中，一般按照2000~4000个/cm2的细胞密度将所述软骨细胞接种在培养基上进行细胞原代培养，且所述细胞原代培养和细胞传代培养的培养基均包含体积分数5~20%的患者离体血清、20~40ng/mlFGF和20~40ng/mlPDGF，其中，采集的离体血清为少量，这样既不影响患者自身的身体健康和正常运动，又能避免扩增培养形成的软骨细胞的免疫排斥现象，可以在临床使用。20~40ng/mlFGF和20~40ng/mlPDGF为生长因子，均能促进软骨细胞的增殖，保持软骨细胞的表型，抑制软骨细胞去分化，诱导软骨细胞实现数量级扩增。
[0021]优选地，所述患者自体血清可以通过以下方式获得:抽取患者静脉血40~50ml,置于含10u/ml肝素的40~50ml生理盐水中，3000~3500转/分钟离心10~20分钟，提取上层血清，于温度4°C保存，这样可以更好地满足细胞培养基所需的基本用量和要求。在一优选实施例中，所述细胞原代培养和细胞传代培养的培养基都还包括10-12mmol/LHEPES缓冲液、70-75 μ mol/L硫酸庆大霉素、22-25 μ mol/L 二性霉素B以及300-310 μ mol/L抗坏血酸，形成完全培养基，可以有效地实现软骨细胞的数量级扩增。
[0022]上述S02步骤中，为提高细胞贴壁率，在所述细胞原代培养和细胞传代培养中，所述软骨细胞被接种后需静置I~3天，且被接种后每2~4天换一次细胞培养基。一优选实施例中，当所述软骨细胞的汇合度为70~80%、需进行细胞传代培养之前，例如在所述细胞原代培养之后、细胞传代培养之前，通过加入TrypLESelect消化液消化，中止消化后反复吹打细胞，洗涤、按照1:2-3的比例进行传代培养，扩增细胞，可以很好地实现细胞传代培养。上述培养基优选置于25~75cm2的细胞培养瓶中，所述细胞培养瓶放置在细胞培养箱内。进一步地，在所述细胞原代培养和细胞传代培养过程中，为避免支原体等的污染，保证无任何微生物和内毒素污染以有效控制扩增软骨细胞的质量，按照GMP国际质控技术标准，将所述软骨细胞置于空气洁净度10000级，生物安全柜100级的条件下进行扩增培养，这样就可以达到细菌培养阴性，支原体培养阴性，内毒素含量低于0.25EU/ml (临床细胞回植的内毒素含量要求为低于0.5EU/ml)，提高了移植细胞的存活率，也进一步保证了细胞培养的安全性。
[0023]上述方法利用少量的来源于患者的软骨细胞结合GMP生产技术治疗关节软骨缺损临床病例，避免了免疫排斥，安全有效，而且一般从细胞原代培养开始共12-21天后可使软骨细胞由I~2X105个扩增到I~2X IO7个(具体可依据实际细胞数量所需进行扩增培养)，同时细胞均保持了软骨细胞表型，没有去分化为成纤维细胞，细胞的数量和质量均符合临床治疗关节软骨缺损的要求。在临床适用中，将扩增得到的I~2X107个自体软骨细胞离心后收集细胞沉淀,利用自体血清制备成0.5~Iml的细胞悬液，通过注射器注射于关节软骨缺损处，无免疫排斥现象，细胞可以分泌大量的细胞外基质，促使缺损部位再生。
[0024]现以具体的一种可供临床使用的人膝关节软骨细胞体外扩增方法为例，对本发明进行进一步详细说明。`
[0025]实施例1
[0026]一、软骨细胞提取分离、培养与鉴定
[0027]1.软骨细胞提取、分离与培养
[0028](I)患者血清分离
[0029]采集患者静脉血40~50ml，置于含10u/ml肝素的40~50ml生理盐水中，3000~3500转/分钟离心10~20分钟，提取上层血清，0.1微米滤器过滤，4°C保存。
[0030](2)患者非负重区关节软骨采集
[0031]采用关节镜取患者关节非负重区软骨100~200mg。常规消毒、铺单，局部麻醉后，关节镜下取软骨，放入9g/L冷无菌生理盐水中。
[0032](3)软骨细胞的提取分离
[0033]将软骨切碎成0.8~1.2mm3大小，以培养介质(Ham’sF12介质，内含IOmmol/LHEPES缓冲液、70 μ mol/L硫酸庆大霉素、22 μ mol/L 二性霉素Β、300 μ mol/L抗坏血酸)冲洗3次，放入8~IOmL培养介质(内含I~2mg/ml的II型胶原酶)中于37°C条件下消化12~16小时,而后用直径40 μ m的尼龙筛网滤过,1200~1500转/分的速度进行离心,得到的细胞计数为1.0~2.0X 105。按照2000~4000个/cm2的细胞密度接种在25~75cm2的细胞培养瓶中，细胞培养瓶放置在细胞培养箱(37°C，5.0%C02)，按照GMP国际质控技术标准，将所述软骨细胞置于空气洁净度10000级，生物安全柜100级的条件下进行扩增培养。为提高细胞贴壁率，接种后I~2天内勿挪动培养瓶，接种后每2~4天换液一次。
[0034](4)软骨细胞的扩大培养
[0035]参见图1和图2，待I~2周后细胞的汇合度达70~80%时，加入TrypLESelect消化液消化，中止消化后反复吹打细胞，洗涤后按照1:2的比例分瓶接种，扩增细胞。根据患者关节软骨缺损的面积决定细胞的需求量，不断扩增细胞直至达到手术需求量。
[0036]2.常规的软骨细胞的鉴定
[0037]将第1、2代软骨细胞用TrypLESelect消化，PBS洗涤2次，制备106/ml单细胞悬液，接种于6孔板，分别进行甲苯胺蓝染色、II型胶原免疫细胞化学检测。实验结果显示两代内的软骨细胞甲苯胺蓝异染，II型胶原免疫细胞化学阳性。
[0038]二、软骨细胞无外源动物血清的培养
[0039]为了有效避免动物血清可能存在的病毒对细胞造成污染，本发明在培养软骨细胞过程中，所使用的基础培养基为Ham’ sF12介质，内含lOmmol/LHEPES缓冲液、70 μ mol/L硫酸庆大霉素、22 μ mol/L 二性霉素Β、300 μ mol/L抗坏血酸，添加5~20%患者自体血清，20~40ng/mlFGF和20~40ng/mlPDGF生长因子，制备成完全培养基。20~40ng/mlFGF，20~40ng/mlPDGF均能促进软骨细胞的增殖，保持软骨细胞的表型，抑制软骨细胞去分化。
[0040]三、软骨细胞生物安全性检测
[0041]收集第I代至第2代的软骨细胞。按照相关标准检测细胞的成活率、支原体、内毒素，主要参照的标准有:《中国药典》2005版第三部附录XIIA第73页和《组织工程医疗产品第12部分:细胞、组织、器官的加工指南》相关规定；《中国药典》2005版第三部附录规定；人的体细胞治疗申报临床试验指导原则。结果显示:培养扩增的第I代到第2代的软骨细胞未受到细菌、真菌和支原体的污染，内毒素含量低于0.25EU/mL。
[0042]实施例2
[0043]一、软骨细胞提取分离、培养与鉴定
[0044]1.软骨细胞提取、分离与培养
[0045](I)患者血清分离
[0046]采集患者静脉血40~50ml，置于含10u/ml肝素的40~50ml生理盐水中，3000~3500转/分钟离心10~20分钟，提取上层血清，0.1微米滤器过滤，4°C保存。
[0047](2)患者非负重区关节软骨采集
[0048]采用关节镜取患者关节非负重区软骨150mg。常规消毒、铺单，局部麻醉后，关节镜下取软骨，放入9g/L冷无菌生理盐水中。
[0049](3)软骨细胞的提取分离
[0050]将软骨切碎成0.8~1.2mm3大小，以培养介质(Ham’sF12介质，内含IOmmol/LHEPES缓冲液、70 μ mol/L硫酸庆大霉素、22 μ mol/L 二性霉素Β、300 μ mol/L抗坏血酸)冲洗3次，放入8~IOmL培养介质(内含I~2mg/ml的II型胶原酶)中于37°C条件下消化12~16小时，而后用直径40 μ m的细胞滤器滤过，1400转/分的速度进行离心，得到的细胞计数为1.0~2.0X 105。按照3000个/cm2的细胞密度接种在25~75cm2的细胞培养瓶中，细胞培养瓶放置在细胞培养箱(37°C，5.0%C02)，按照GMP国际质控技术标准，将所述软骨细胞置于空气洁净度10000级，生物安全柜100级的条件下进行扩增培养。为提高细胞贴壁率，接种后2天内勿挪动培养瓶，接种后每3天换液(细胞培养基)一次。
[0051](4)软骨细胞的扩大培养
[0052]参见图1和图2，待I~2周后细胞的汇合度达70~80%时，加入
[0053]TrypLESelect消化液消化，中止消化后反复吹打细胞，洗涤后按照1:2的比例分瓶接种，扩增细胞。根据患者关节软骨缺损的面积决定细胞的需求量，不断扩增细胞直至达到手术需求量。
[0054]2.常规的软骨细胞的鉴定[0055]将第1、2代软骨细胞用TrypLESelect消化，PBS洗涤2次，制备106/ml单细胞悬液，接种于6孔板，分别进行甲苯胺蓝染色、II型胶原免疫细胞化学检测。实验结果显示两代内的软骨细胞甲苯胺蓝异染，II型胶原免疫细胞化学阳性。
[0056]二、软骨细胞无外源动物血清的培养方法
[0057]为了有效避免动物血清可能存在的病毒对细胞造成污染，本发明在培养软骨细胞过程中，所使用的基础培养基为Ham’ sF12介质，内含lOmmol/LHEPES缓冲液、70 μ mol/L硫酸庆大霉素、22 μ mol/L 二性霉素Β、300 μ mol/L抗坏血酸，添加18%患者自体血清，30ng/mlFGF和30ng/mlPDGF生长因子，制备成完全培养基。30ng/mlFGF，30ng/mlPDGF均能促进软骨细胞的增殖，保持软骨细胞的表型，抑制软骨细胞去分化。
[0058]三、软骨细胞生物安全性检测
[0059]收集第I代至第2代的软骨细胞。按照相关标准检测细胞的成活率、支原体、内毒素，主要参照的标准有:《中国药典》2005版第三部附录XIIA第73页和《组织工程医疗产品第12部分:细胞、组织、器官的加工指南》相关规定；《中国药典》2005版第三部附录规定；人的体细胞治疗申报临床试验指导原则。结果显示:培养扩增的第I代到第2代的软骨细胞未受到细菌、真菌和支原体的污染，内毒素含量低于0.25EU/mL。
[0060]自体软骨细胞移植治疗关节软骨缺损的临床实验
[0061]1.病例选择:
[0062]患者无类风湿性关节炎，无骨性关节炎，并无感染性关节病，患侧关节的稳定性、力线无异常。
[0063]2.治疗方法:
[0064]关节镜下检查并收集自体软骨。首先进行关节镜检查，评估韧带、半月板情况，观察软骨缺损的位置、大小及缺损周围组织的情况，从内侧或外侧髁非负重区收集100~200mg软骨。获取离体软骨后，提取分离软骨细胞，体外扩增培养鉴定软骨细胞，同时按照上述方法对扩增培养的软骨细胞进行安全性检测。2~3周后，患者再次入院，行内侧或外侧髌旁切口，将软骨缺损区修整，避免软骨下出血，缺损区大小用铝片测量，在胫骨近端或股骨近端取稍大于缺损面积形状相宜的骨膜片，骨膜覆盖缺损区，再用6-0的可吸收线缝合固定，骨膜周围用纤维蛋白胶封闭按照病患缺损面积大小计算细胞悬液体积，用离体血清将体外扩增的软骨细胞制成细胞悬液，并注射至缺损区，注射部位再次用纤维蛋白胶进行封闭。置引流条，肌肉皮肤分层缝合，包扎固定患侧关节。[0065]3.效果分析
[0066]患者接受手术后的第I周、第4周、第6周、第8周、第24周来院复诊，观察骨关节软骨缺损部位症状变化情况。并于24周对移植部位进行MRI观察。结果显示:通过自体软骨细胞移植治疗后，患者日常生活逐渐得到恢复，运动时的疼痛感有显著缓解。通过MRI观察发现通过自体软骨细胞与骨膜复合的治疗，不但有效阻止了软骨缺损的发展趋势，同时原有软骨缺损部位也得到了一定程度的修复。
[0067]通过本发明，使人膝关节非负重区软骨细胞在体外增殖，不但能数量级扩增人软骨细胞，并按照临床应用的细胞培养规范进行体外扩增，所得到的软骨细胞进行移植，并与骨膜复合后，用于治疗膝关节软骨缺损。
[0068]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的 任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种可供临床使用的人膝关节软骨细胞体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤: 对患者的离体软骨进行分离提取，获得软骨细胞； 将所述软骨细胞接种至培养基中进行细胞原代培养； 待所述细胞原代培养中的所述软骨细胞的汇合度为70~80%时进行细胞传代培养； 其中，所述细胞原代培养和所述细胞传代培养的培养基均含有体积分数5~20%的患者离体血清、20 ~40ng/mlFGF 和 20 ~40ng/mlPDGF。
2.如权利要求1所述的人膝关节软骨细胞体外扩增方法，其特征在于，在所述细胞原代培养和细胞传代培养过程中，按照GMP国际质控技术标准，将所述软骨细胞置于空气洁净度10000级，生物安全柜100级的条件下进行培养。
3.如权利要求1或2所述的人膝关节软骨细胞体外扩增方法，其特征在于，所述患者离体血清通过以下方式获得:抽取患者静脉血40~50ml，置于含10u/ml肝素的40~50ml生理盐水中，3000~3500转/分钟离心10~20分钟，提取上层血清，于温度4°C保存。
4.如权利要求1所述的人膝关节软骨细胞体外扩增方法，其特征在于，在所述分离提取的步骤之前，将所述离体软骨切成0.8~1.2mm3大小的软骨组织块，进行消化处理12~16小时，制得单个形式的悬浮软骨细胞。
5.如权利要求4所述的人膝关节软骨细胞体外扩增方法，其特征在于，所述消化处理步骤中，所使用的消化介质包括I~2mg/ml的II型胶原酶，消化处理的温度为37°C。
6.如权利要求1或2或4所述的人`膝关节软骨细胞体外扩增方法，其特征在于，在所述细胞原代培养和细胞传代培养步骤中，所述软骨细胞被接种后需静置I~3天，且被接种后每2~4天换一次细胞培养基。
7.如权利要求1所述的人膝关节软骨细胞体外扩增方法，其特征在于，在所述分离提取步骤中，采用离心分离，离心速度为1200~1500转/分。
8.如权利要求1或2或4所述的人膝关节软骨细胞体外扩增方法，其特征在于，所述细胞原代培养和所述细胞传代培养的培养基都还包括10-12mmol/LHEPES缓冲液、70-75 μ mo I/L硫酸庆大霉素、22-25 μ mo I/L 二性霉素B以及300-310 μ mo I/L抗坏血酸。
9.如权利要求1或2或4或5所述的人膝关节软骨细胞体外扩增方法，其特征在于，在所述细胞原代培养之后、细胞传代培养之前，加入TrypLESelect消化液消化，中止消化后反复吹打软骨细胞，洗涤、分开接种，进行所述细胞传代培养以扩增细胞。
10.如权利要求1所述的人膝关节软骨细胞体外扩增方法，其特征在于，所述培养基置于25~75cm2的细胞培养瓶中，所述细胞培养瓶放置在细胞培养箱内。
【文档编号】C12N5/077GK103881969SQ201310753473
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】段莉, 王大平, 朱伟民, 陈洁琳, 熊建义, 陆伟, 彭亮权 申请人:深圳市第二人民医院