一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及软骨保存方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及软骨保存方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着我国人们生活水平的提高以及体育运动的全面普及，关节软骨损伤患者显著增多。异体骨软骨移植修复关节软骨缺损取得了一系列令人鼓舞的进展。软骨移植是目前治疗软骨病变的十分有前景的修复方法之一。因为异体软骨移植材料获得相对较易且可预制成任意形状和大小，便于将正常功能的关节软骨制成各种形状植于骨缺损处，恢复软骨的外形，而且先期实验证明，证明低温保存后的软骨的免疫原性大大降低，从而提高软骨移植的成活率，达到修复软骨损伤的目的，所以比自体移植应用前景更佳。而且软骨移植物经过一段时间保存后可择期完成关节重建手术，并且有充裕的时间进行多项检测，防止供者可能带来的病毒或细菌感染，且可降低免疫原性。
[0003]实验表明，经低温冷冻保存的同种异体骨软骨移植治疗膝关节软骨缺损获得了满意的效果，但是生物材料(细胞、组织、器官)脱离供体后实现长时间的保存很难。伴随着低温保存技术的不断发展，学者们发现:在深低温环境中的离体生物材料会逐渐减缓其新陈代谢，甚至停止新陈代谢，因此能够使其得以长期保存。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种关节软骨移植物玻璃化冷冻冷冻保护液及其保存方法，旨在解决现有的长期持续保持关节软骨移植物的活性和软骨细胞成存活率低、体外保存时间短的问题。
[0005]本发明是这样实现的，一种关节软骨移植物玻璃化保护液及软骨保存方法，该保护液每100ml包括:99.9%二甲基亚砜150?250ml、乙酰胺110?200g、1，2-丙二醇70?120ml、聚乙二醇(8000) 10?80g、海藻糖20?100g、余为去离子水。
[0006]进一步，该软骨玻璃化保护液的pH值为7.30?7.50 ;处理后软骨块封装后在液氮中保存。
[0007]本发明的关节软骨玻璃化冷冻保护液，每100ml含99.9%二甲基亚砜160ml、乙酰胺125g、l，2-丙二醇80ml、聚乙二醇(8000) 30g、海藻糖40g、余为去离子水。
[0008]本发明的关节软骨玻璃化冷冻保护液，每100ml含99.9%二甲基亚砜205ml、乙酰胺155g、l，2-丙二醇100ml、聚乙二醇(8000) 60g、海藻糖60g、余为去离子水。
[0009]本发明的关节软骨玻璃化冷冻保护液，每100ml液含99.9%二甲基亚砜225ml、乙酰胺190g、l，2-丙二醇115ml、聚乙二醇(8000) 70g、海藻糖90g、余为去离子水。
[0010]本发明的另一目的在于提供一种关节软骨玻璃化冷冻保存方法，方法包括如下步骤:
[0011]步骤一，取99.9%二甲基亚砜、乙酰胺、1，2-丙二醇、聚乙二醇(8000)、海藻糖和去离子水；
[0012]步骤二，将步骤一的原料配制成溶液，搅拌均匀，调节PH值至7.30?7.50 ;
[0013]步骤三，把新鲜同种异体骨软骨移植物经磷酸盐缓冲液清洗3-5次；
[0014]步骤四，将步骤三骨软骨移植物将骨软骨块在4°C下经梯度玻璃化溶液:1/3浓度玻璃化保护液、2/3浓度玻璃化保护液、3/3玻璃化保护液等逐级依次浸泡10分钟，用冷藏管封装，做好标记，然后直接以最快速度投入液氮中保存。
[0015]本发明的另一目的在于提供一种骨软骨移植物玻璃化冷冻保护液及软骨保存方法在软骨组织库的应用。
[0016]本发明的另一目的在于提供一种软骨玻璃化保护液及软骨保存方法在临床同种异体骨软骨移植术治疗关节软骨损伤中应用。
[0017]本发明提供的玻璃化冷冻保护液及软骨保存方法，使软骨细胞存活率在冷冻保存第8周时仍保持在一个较高水平(由传统组的60%提高到68% )，能够能有效提高骨软骨移植物保存效果、延长体外骨软骨移植物的保存时间，从而为建立软骨组织库，扩大同种异体骨软骨移植修复软骨缺损临床技术推广应用，为骨软骨缺损患者的快速康复带来福音。
【附图说明】
[0018]图1是本发明实施例提供的关节软骨移植物玻璃化冷冻保护液的制备及软骨保存方法流程图；
[0019]图2是本发明实施例提供的新型软骨移植物玻璃化冷冻保护液与对照组保护液保存猪关节骨软骨组织在保存第8周时软骨细胞成存活率示意图。
【具体实施方式】
[0020]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0021]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0022]本发明实施例的软骨玻璃化保护液包括??每100ml骨软骨移植物保护液包括:99.9%二甲基亚砜150?250ml、乙酰胺110?200g、l, 2-丙二醇70?120ml、聚乙二醇(8000) 10?80g、海藻糖20?100g、余为去离子水；将原料配制成溶液，搅拌均匀，调节PH值至7.30?7.50 ;把新鲜同种异体骨软骨移植物经磷酸盐缓冲液清洗3-5次；将骨软骨块在4°C下经梯度玻璃化溶液:1/3浓度玻璃化保护液、2/3浓度玻璃化保护液、3/3玻璃化保护液逐级依次浸泡10分钟，用冷藏管封装，做好标记，然后直接以最快速度投入液氮中保存。本发明的另一目的在于提供一种软骨玻璃化保护液在骨软骨组织库的应用。
[0023]如图1所示，本发明实施例的关节软骨玻璃化冷冻保护液及软骨保存方法包括以下步骤:
[0024]SlOl:取99.9%二甲基亚砜、乙酰胺、1，2-丙二醇、聚乙二醇(8000)、海藻糖、余为去离子水，配制成溶液，搅拌均匀，滴定法调节PH值至7.30?7.50 ;
[0025]S102:把新鲜同种异体骨软骨移植物经磷酸盐缓冲液清洗3-5次；
[0026]S103:将步骤二骨软骨移植物将骨软骨块在4°C下经梯度玻璃化溶液:1/3浓度玻璃化保护液、2/3浓度玻璃化保护液、3/3玻璃化保护液等逐级依次浸泡10分钟，用冷藏管封装，做好标记，然后直接以最快速度投入液氮中保存；
[0027]S104:使用时将软骨块取出进行复温:冷冻骨软骨块取出后，立即行37°C水浴复温10秒，然后依次投入37°C 10%、5%蔗糖溶液中各停留5分钟，最后磷酸盐缓冲液液冲洗3遍。
[0028]本发明的具体实施例:如图2所示:
[0029]实施例1:每100ml玻璃化保护液包括:99.9%二甲基亚砜160ml、乙酰胺125g、1，2-丙二醇80ml、聚乙二醇(8000) 30g、海藻糖40g、余为去离子水，将原料配制成溶液，搅拌均匀，调节PH值