软骨损伤治疗剂及其制造方法

软骨损伤治疗剂及其制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及软骨损伤治疗剂及其制造方法，进一步设及该制造方法所使用的培养 基用添加剂、培养用培养基和试剂盒、W及使用它们的培养方法。
【背景技术】
[0002] 在膝等关节部位，位于滑膜内侧的活动性关节中存在的软骨组织由II型胶原蛋 白、蛋白聚糖和水等构成，将其定义为关节软骨（透明软骨）。另一方面，作为关节部位W外 存在的软骨组织的构成成分，与II型胶原蛋白相比，多数为I型胶原蛋白。
[0003] 关节软骨修复能力低，一旦损伤时基本不可能自然再生。具有外伤性关节软骨损 伤且反复出现强烈的疼痛和/或关节水肿时，进行内服止痛药的治疗和/或透明质酸的关 节内注射，但是运些治疗方法均是对症疗法，不是根本的治疗方法。因此，作为现在的常见 的治疗方法，采用外科再生关节软骨的方法。作为主要的外科治疗方法，已知非专利文献1 记载的骨穿孔法和自体骨软骨移植术。
[0004] 非专利文献1的骨穿孔法是使用钻对软骨损伤部的骨打孔，使从骨髓出血，将骨 髓中含有的间充质干细胞（MSC:MesenchymalstemCell)诱导至损伤部，期待软骨和类似 于软骨的组织再生的方法。由于不牺牲自身的组织，且能够在关节镜观察下简便实施，因 此，目前为止作为软骨损伤的首选治疗法在世界范围内广泛进行。
[00化]此处，干细胞是具有自我复制能力和分化能力的细胞。作为运类干细胞，例如已知 有胚胎干细胞（ES细胞）、诱导多能干细胞（iPS细胞）、和成体干细胞等。作为上述成体干 细胞，例如有造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞等。上述ES细胞和上述iPS细胞具 有能够向所有组织分化的多分化能力。上述造血干细胞具有向血液细胞分化的能力，上述 神经干细胞具有向神经细胞分化的能力。另外，上述间充质干细胞存在于骨髓等组织中，作 为具有向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞等分化的多分化能力的干细胞而被熟知。
[0006] 非专利文献1的自体骨软骨移植术是从自体关节软骨的健康部W圆柱状切去一 块骨和软骨并自体移植（Autograft)至损伤部的方法，虽然能够利用移植的透明软骨和 其间隙的纤维性软骨进行修复，但是存在对健康部组织造成损伤和移植面积受到限制的缺 点。
[0007]另外，作为关节软骨损伤的其他外科治疗法，已知有自体培养软骨移植术。自体培 养软骨移植术是化ittberg等于1994年报告的方法，其是从患者自体的非负荷部的膝关节 软骨采取少量的软骨组织，将分离和单层培养的软骨细胞移植于软骨损伤部的方法。
[0008] 作为关节软骨损伤的另一外科的治疗法，已知专利文献1记载的利用人组织工程 灯issueengineering)的治疗方法。该治疗方法中，将软骨细胞或干细胞等细胞源与支架 材料组合移植至关节软骨损伤部位，促进关节软骨的再生。
[0009] 另外，在大阪大学医学部附属医院实施的人干细胞临床研究"针对关节软骨病变 的自身滑膜间充质干细胞来源Ξ维人工组织治疗法"(2012年1月25日获得计划审批），将 外伤性膝软骨损伤患者作为对象。该临床研究是将从关节内组织分离的滑膜干细胞进行培 养，给予生物学的刺激而得到立体的组织片后，将其移植至软骨损伤部位的方法。
[0010] 现有技术文献
[0011] 专利文献
[0012] 专利文献1:国际公开第2005/012512号小册子（2005年2月10日公开）
[0013] 非专利文献
[0014] 非专利文献1:整形外科Knack&Pit化11s膝关节外科的要点和盲点，黑坂昌弘， 2005

【发明内容】

[0015] 但是，上述W往的利用间充质干细胞的关节软骨损伤的治疗方法存在W下所示的 问题。
[0016] 目P，对于非专利文献1记载的骨穿孔法，最近的报告表明，治疗部位的软骨组织随 时间推移由透明软骨置换为纤维软骨，组织容易受到损伤，W及治疗后2年左右临床症状 的改善良好，但是经过5年W上时疼痛复发，患者的活动性降低，难W期待长时间的治疗效 果。另外，非专利文献1的骨穿孔法中，为了使血液流入软骨组织，开孔的骨不被修复。
[0017] 另外，非专利文献1的自体骨软骨移植术，存在必须牺牲健康部的软骨组织，将中 老年患者作为对象时，由于伴随年龄增加而健康的软骨的范围变少，所W不能采取到软骨 损伤治疗所需要的量的软骨组织的问题。另外，非专利文献1的自体骨软骨移植术中，从患 者取得的移植片在新鲜时，移植片的生物活性得到保持，但是将移植片冷冻时则生物活性 丧失。因此，每次移植都需要从患者取得新鲜的移植片，患者的负担增大。
[0018] 自体培养软骨移植术是能够解决骨穿孔法和自体骨软骨移植术中的上述问题的 治疗法，但是W前在日本作为保险诊疗并没有获得认可。但是，在2012年7月，将从患者自 体的软骨组织分离的软骨细胞包埋于端缺胶原凝胶而培养的自体培养软骨JACC(注册商 标）在日本获得批准。另外，同样地，在美国Carticel(注册商标）于1997年8月，在欧洲 化omlroCelect(注册商标）于2009年10月获得批准。因此，自体培养软骨移植术，作为针 对外伤性软骨缺失症的新的治疗法受到注目，但由于在其适用范围没有其他治疗法，且将 软骨缺失面积为4cm2W上的软骨缺失部位作为适用范围，因此，其适用范围非常有限。
[0019] 另外，专利文献1的治疗方法，在关节软骨的再生上花费时间，进一步需要进行重 复移植。
[0020] 而且，在针对关节软骨病变的来源于自身滑膜间充质干细胞的Ξ维人工组织治疗 法中，由于在含有血清的培养基中培养自体来源的间充质干细胞并使用，因此需要从患者 取得细胞，患者的负担增大，而且如后述所示存在血清引起的细胞污染等风险。
[0021] 将间充质干细胞等细胞用于关节软骨损伤治疗时，在投予之前培养细胞，作为此 时的培养基，现在广泛使用添加动物血清（通常10~15%胎牛血清）的培养基。该血清作 为用于促进在体外的细胞的生长和/或增殖的营养源或激素等生理活性物质的供给源而 使用。
[0022] 但是，血清非常昂贵，而且是天然制品，因此每批之间产生成分的差异。因此，细胞 增殖效果容易产生波动。另外，为了从培养后的细胞除去来源于血清的蛋白质等而需要精 审IJ，操作变得复杂。而且，存在混入血清中的未知病原体（病毒和病原性航病毒等）引起培 养细胞被污染的危险性。
[0023] 本发明是鉴于上述问题点而完成的发明，其目的在于提供能够很好地使软骨再生 的含有无血清培养的间充质干细胞的软骨损伤治疗剂及其制造方法，进一步能够提供该制 造方法所使用的培养基用添加剂、培养用培养基和试剂盒、W及使用运些物质的培养方法。
[0024] 本发明设及的软骨损伤治疗剂的制造方法，其特征在于，包含W下工序：在含有 FGF、PDGF、TGF-e、HGF、EGF、至少一种憐脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基A中，使间充 质干细胞增殖的增殖工序；将上述增殖工序后的间充质干细胞、等张保存剂和细胞保护剂 混合的混合工序。
[00巧]本发明设及的软骨损伤治疗剂，其特征在于，含有间充质干细胞、等张保存剂和细 胞保护剂，上述间充质干细胞是在含有FGF、PDGF、TGF-e、HGF、EGF、至少一种憐脂和至少一 种脂肪酸的无血清培养基A中培养而得到的。
[00%] 本发明设及的培养用培养基，其特征在于，是用于制造软骨损伤治疗剂的无血清 的培养用培养基，含有本发明设及的培养基用添加剂。
[0027] 本发明设及的培养方法，其特征在于，是用于制造软骨损伤治疗剂的培养方法，包 含在本发明设及的培养用培养基中培养间充质干细胞的工序。
[0028] 本发明设及的试剂盒，其特征在于，至少具有本发明设及的培养基用添加剂。
[0029] 本发明设及的软骨损伤治疗剂的制造方法，由于包含在含有FGF、PDGF、TGF-β、 HGF、EGF、至少一种憐脂和至少一种脂肪酸的无血清培养基A中使间充质干细胞增殖的增 殖工序W及将上述增殖工序后的间充质干细胞、等张保存剂和细胞保护剂混合的混合工 序，所W发挥W下效果，即能够制造含有无血清培养的间充质干细胞并能够很好地使软骨 损伤部位再生的软骨损伤治疗剂。
【附图说明】
[0030] 图1是说明本发明机理的示意图。
[0031] 图2是表示正常软骨的染色图像的显微镜图像的图。（a)表示苏木精?伊红染色 图像，化）表示甲苯胺蓝染色图像，（C)表示藏红0染色图像。 阳03引图3是表示将含有MSC5X105个和乳酸林格氏液1血的细胞投予液单次投予至 软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。（a)表示肉眼图像，化）表示苏木精?伊红 染色图像，（C)表示甲苯胺蓝染色图像，（d)表示藏红0染色图像。 阳03引图4是表示将含有MSC 5X105个、乳酸林格氏液990 μΙ和透明质酸1% 10化（透 明质酸浓度0.01% )的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像 的图。（a)表示肉眼图像，化）表示苏木精?伊红染色图像，（C)表示甲苯胺蓝染色图像，（d) 表示藏红0染色图像。
[0034] 图5是表示将含有MSC5X105个、乳酸林格氏液900μL和透明质酸1 % 100μL(透明质酸浓度0. 1% )的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显 微镜图像的图。（a)表示肉眼图像，化）表示苏木精?伊红染色图像，（C)表示甲苯胺蓝染 色图像，（d)表示藏红0染色图像。 阳03引 图6是表示将含有MSC5X105个、乳酸林格氏液500μL和透明质酸1 % 500μL(透明质酸浓度0. 5% )的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显 微镜图像的图。（a)表示肉眼图像，（b)表示苏木精?伊红染色图像，（c)表示甲苯胺蓝染 色图像，（d)表示藏红0染色图像。
[0036] 图7是表示将含有MSC5X106个和乳酸林格氏液1血的细胞投予液单次投予至 软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。（a)表示肉眼图像，化）表示苏木精?伊红 染色图像，（C)表示甲苯胺蓝染色图像，（d)表示藏红0染色图像。
[0037] 图8是表示将含有MSC5X106个、乳酸林格氏液990μΙ和透明质酸1% 10化（透 明质酸浓度0.01% )的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像 的图。（a)表示肉眼图像，化）表示苏木精?伊红染色图像，（C)表示甲苯胺蓝染色图像，（d) 表示藏红0染色图像。 阳03引 图9是表示将含有MSC5X106个、乳酸林格氏液900μL和透明质酸1 % 100μL(透明质酸浓度0. 1% )的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显 微镜图像的图。（a)表示肉眼图像，化）表示苏木精?伊红染色图像，（C)表示甲苯胺蓝染 色图像，（d)表示藏红0染色图像。
[0039] 图10是表示将含有MSC5X106个、乳酸林格氏液500μΙ和透明质酸1% 500μL(透明质酸浓度0. 5% )的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显 微镜图像的图。（a)表示肉眼图像，化）表示苏木精?伊红染色图像，（C)表示甲苯胺蓝染 色图像，（d)表示藏红0染色图像。 W40] 图11是表示将含有MSC5X107个和乳酸林格氏液1血的细胞投予液单次投予至 软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。（a)表示肉眼图像，化）表示苏木精?伊红 染色图像，（C)表示甲苯胺蓝染色图像，（d)表示藏红0染色图像。 阳0川图12是表示将含有MSC5X107个、乳酸林格氏液500μΙ和透明质酸1% 500μL(透明质酸浓度0. 5% )的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显 微镜图像的图。（a)表示肉眼图像，化）表示苏木精?伊红染色图像，（C)表示甲苯胺蓝染 色图像，（d)表示藏红0染色图像。
[0042]图13是表示将仅含有乳酸林格氏液ImL的投予液单次投予至软骨半层缺失部位 时的肉眼和显微镜图像的图。（a)表示肉眼图像，化）表示苏木精?伊红染色图像，（C)表 示甲苯胺蓝染色图像，（d)表示藏红0染色图像。
[0043] 图14是表示将含有乳酸林格氏液500μL和透明质酸1% 500μL(透明质酸浓度 0.5%)的投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显微镜图像的图。（a)表示肉眼 图像，化）表示苏木精?伊红染色图像，（C)表示甲苯胺蓝染色图像，（d)表示藏红0染色图 像。 W44] 图15是表示将含有MSC5X107个、乳酸林格氏液990μΙ和透明质酸1% 10μL(透明质酸浓度0. 01% )的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显 微镜图像的图。（a)表示肉眼图像，化）表示苏木精?伊红染色图像，（C)表示typell胶原 蛋白染色图像，（d)表示藏红0染色图像。 W45] 图16是表示将含有MSC5X107个、乳酸林格氏液900μΙ和透明质酸1% 100μL(透明质酸浓度0. 1% )的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位时的肉眼和显 微镜图像的图。（a)表示肉眼图像，化）表示苏木精?伊红染色图像，（C)表示typell胶原 蛋白染色图像，（d)表示藏红0染色图像，（e)表示甲苯胺蓝染色图像。
[0046] 图17是表示将细胞投予液单次投予的关节内健康软骨的显微镜图像的图。（a)表 示苏木精?伊红染色图像，化）表示甲苯胺蓝染色图像，（C)表示藏红0染色图像。
[0047] 图18是表示将细胞投予液单次投予的关节内健康滑膜的显微镜图像的图。（a)表 示苏木精?伊红染色图像，化）表示甲苯胺蓝染色图像，（C)表示藏红0染色图像。 W48] 图19是表示结果最好的、将含有MSC5X1〇6个、乳酸林格氏液990μL和透明质 酸1 % 10μL(透明质酸浓度0. 01 % )的细胞投予液单次投予至软骨半层缺失部位的个体 的进行了typell胶原蛋白免疫染色的显微镜图像（低倍率放大）的图。 W例图20是表示结果最好的、将含有MSC5X106个、乳酸林格氏液990μL和透明质 酸1 % 10μL(透明质酸