专利名称：修复软骨损伤之外科移植物的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种用于修复软骨损伤之外科移植物。
背景技术：
从1994年起，自体软骨细胞移植已被用于治疗软骨损伤，包括从正常软骨组织收集软骨细胞，尽可能地在体外于培养基中扩增这些细胞，接着藉由将此等扩增的细 胞移植于人工支架，以充填软骨损伤。然而，仍有许多问题；例如，自体软骨细胞的来源 有限，软骨细胞的增殖能力低下，以及它们独特的表型在扩增时可能会消失(Saadeh et al.，Human cartilageengineering :chondrocyte extraction, proliferation, and characterization forconstruct development. Ann Plast Surg 1999 ；42 :509_13)。间质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)能分化成结缔组织细胞系之细胞， 包括软骨，也因此成为软骨组织工程之受人瞩目的细胞来源。许多方法曾被用于MSCs的 软骨生成诱导。Kavalkovich等人提出团状培养法来模拟胚胎软骨发育之环境，其可获得 高细胞密度之细胞，但是带有大量细胞的紧密细胞团却只有小量的软骨组织出现。因此， 修复软骨缺损需要相当大量的细胞团块，然而大团块显示出周边有存活的细胞但团块中心 坏死(Kavalkovich et al. ,Chondrogenic differentiation of humanmesenchyma 1 stem cells within an alginate layer culture system. In Vitro CellDev Biol Anim 2002 ； 38 :457-66.)。此外，团块不易操作及塑型成多种形状以供损伤修复所需。有鉴于此，团状培 养并无法用于手术应用。再者，发现将人类MSCs (human MSCs，hMSCs)，包入洋菜胶或海藻酸 盐胶可被塑造成多种形状并且形成实质上的软骨新生(Huang et al.，Chondrogenesisof human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in agarose culture. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 2004 ；278 :428-36 ；and Ma et al. ， Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginatebeads. J Biomed Mater Res A 2003;64:273-81)。然而，海藻酸盐或洋菜胶支架用于软骨组织工程有其缺点细胞贴 附差，而且当二价阳离子扩散于周围的培养基时，无法控制海藻酸盐的降解。此外，海藻酸 盐基质过去曾用于活体内时，有报导指出当用于移植以治疗实验动物的软骨之全层损伤 (full-thickness defects)时，会有严重的异体性巨大细胞反应与免疫反应(Hunziker， Articular cartilage repair :basic science and clinical progress. Areview of the current status and prospects. Osteoarthritis Cartilage 2001 ；O :432_63)。因此，海 藻酸盐基质尚未曾用于人类患者的关节软骨修复。所以，仍有需要来发展一种外科移植物以修复病患的软骨损伤。
发明内容
本发明是基于两个非预期的新发现，即(1) 一种含包有类软骨细胞之胶原蛋白基质之移植物，当其移植到软骨损伤区时会修复软骨损伤，以及( 在移植物与移植位置的 组织间无空隙形成。
因此，本发明一方面的特征是一种软骨损伤-修复移植物，其包括胶原蛋白基质， 其包入类软骨细胞并添加转化生长因子-β ICTransforminggrowth factor beta one, TGF-βΙ)。此移植物不具骨陷窝(Lacuna)，其制备方式是经由间质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)培养于含胶原蛋白之培养基，其添加转化生长因子-β 1 (Transforming growth factor beta one，TGF-B1)，条件为容许MSCs之分化成为类软骨细胞及移植物之形 成。该类软骨细胞分泌糖胺聚多糖。该MSC可从骨髓、脂肪组织、肌肉组织、脱落乳牙的牙 髓、脐带血、瓦顿氏凝胶、胎盘或脐带内膜中获得。在实例中，该培养步骤经以下达成将该MSCs培养于含胶原蛋白之培养基，添加 TGF- β 1，达7至21天，条件为容许该MSCs之分化成为类软骨细胞，该类软骨细胞包于胶原 蛋白基质中。该含胶原蛋白之培养基较佳具有约1至约10% (w/v)(例如，约3% (w/v)) 之胶原蛋白浓度。此培养步骤可实施于胶囊中。本发明的另一方面特征是一种修复软骨损伤的方法，其为在需要治疗的个体中将 上述移植物放置于软骨损伤位置。在一实例中，该移植物以一种类注射器活塞递送至缺陷 位置。在另一实例中，装载于胶囊内之移植物藉由将其从胶囊中挤出并施用于该位置而递 送至缺陷位置。以下将详细说明本发明之各种具体实施例。本发明的其它特征，将由以下的详细 说明与关于各种具体实施例的附图及权利要求书而清楚地呈现。
为了说明本发明之目的，附图显示目前最佳具体实施例。然而，应了解的是，本发 明不受所示最佳实施例所示之限制。在附图中图1显示9位患者依照本发明方法处理后的IKDC分数，其中经由学生t检定发现， 术后6个月和12个月有显著改善。图2显示依本发明方法处理后的患者在移植12个月后的内视镜观察影像；在移植 位置与细胞-基质复合物所制作的手术移植物之间无空隙。
具体实施例方式本发明的特征是一种用移植物修复患者软骨损伤的方法，该移植物包括胶原蛋白 基质，其包入类软骨细胞并添加转化生长因子-β ICTransforming growth factor beta one，TGF-β 1)，其中该类软骨细胞系从间质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)分化 而来并且分泌糖胺聚多糖，藉此软骨损伤得以修复且在移植物之间无任何空隙。除另有定义外，此处使用的所有技术与科学术语具有的意义为本领域技术人员所 公知。此处所用，除另外指明，以下的术语有它们所属之意义。此处所用的冠词“一”和“该”指的是一个或一个以上(例如，至少一种)之文法 上受词的冠词。举例来说，“该元素”指的是一个元素或一个以上的元素。此处所称“间质干细胞”或“MSCs”指的是从成体组织取得的多能性干细胞，包括 但不限于骨髓、脂肪组织、肌肉组织、脱落乳牙的牙髓、脐带血或瓦顿氏凝胶。此处所称“软骨细胞”指的是成熟软骨细胞，其被包入基质的骨陷窝(小空腔)内。
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软骨细胞的产生为经由间质软骨生成细胞分化成软骨母细胞，其为产生软骨基质 的最早期细胞。成熟软骨细胞是大型分泌性细胞，带有球状细胞核与明显的核仁。因此，软 骨细胞之骨陷窝的形成被认为是成熟软骨细胞的特征。此处所称“类软骨细胞”指的是具有软骨分泌性细胞的特性的细胞，例如，分泌糖 胺聚多糖(glycosaminoglycan，GAG)，但不形成骨陷窝(lacuna)，其为成熟软骨细胞的典 型特性。此处所称“胶原蛋白基质”指的是组织工程产物，其通过将MSCs培养于含胶原蛋 白的培养基而形成，其包入类软骨细胞，该类软骨细胞能分泌糖胺聚多糖(GAG)且不具骨陷窝(lacuna)。本发明提供一种用以修复患者软骨损伤的方法，其包括提供一种移植物，其包含胶原蛋白基质，其包入类软骨细胞并添加转化生长因 子-β 1，该类软骨细胞从间质干细胞(MSCs)分化而来并且分泌糖胺聚多糖，以及将移植物放置于患者软骨损伤处；其中该移植物不具骨陷窝(lacuna)。在本发明中，移植物包含胶原蛋白基质，其包入类软骨细胞与添加转化生长因 子-β 1(TGF-β 1)，可经由以下方法获得该MSCs培养于含胶原蛋白之培养基，其添加转化 生长因子-β 1 (Transforming growth factor betaone，TGF-β 1)，其条件为容许 MSCs 之 分化成为类软骨细胞及移植物之形成。在本发明之实例中，MSCs培养于含胶原蛋白(例如，第一型或第二型胶原蛋白)之 培养基，其添加转化生长因子-β 1 (TGF- β 1)，以分化MSCs成为类软骨细胞，其通过评估糖 胺聚多糖(GAG)含量来确认其特征，以确保该MSCs已诱导成为类软骨组织，并检测是否已 形成骨陷窝。收集包入类软骨细胞的胶原蛋白基质；其为一种作为移植物之组织工程建构 物。在本发明之实例中，将该MSCs予以扩增及培养，然后包入并培养在包含胶原 蛋白的培养基中，其添加转化生长因子-β l(Transforming growthfactor beta one, TGF-β 1)，条件为容许MSCs之分化成为类软骨细胞及移植物之形成。收集包入分泌糖胺聚 多糖(GAG)之类软骨细胞的胶原蛋白基质。该胶原蛋白基质可通过常规方法来检验，确认 未发生骨陷窝(lacuna)之形成以及包入其中的类软骨细胞分泌GAG。在本发明中，可使用任何标准方法、条件或技术，容许MSCs之分化成为类软骨细 胞及胶原蛋白基质之形成作为移植物。在本发明一实例中，胶原蛋白可以是第一型或第二型胶原蛋白或其组合。胶原蛋 白的浓度可以约1 %至约10 %，较佳地约3 %。根据本发明，该移植物可以轻易地经由类注射器活塞递送至软骨损伤区。在本发 明之一具体实施例中，移植物被装入胶囊，且该移植物藉由将其从胶囊中挤出并施用于软 骨损伤区而予以放置。因此，本发明也提供一种用于修复软骨损伤之移植物，其包括胶原蛋白基质， 其包入类软骨细胞并且添加转化生长因子-β 1(TGF-β 1)，该类软骨从间质干细胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)分化而来并且分泌糖胺聚多糖，其中该移植物不具骨陷 ill (Lacuna)。根据本发明，移植物可通过以下方法制备，其包括
提供间质干细胞(MSCs)；以及将该MSCs培养于含胶原蛋白之培养基，其添加转化生长因子-β 1 (Transforming growth factor beta one, TGF-β 1)，其条件为容许MSCs分化成为类软骨细胞及移植物之 形成。本发明现将参考以下具体实施例更具体地描述，其目的是作为例示而非限制。实例1 分离及培养人类MSCsIOmL的肝素化骨髓血从骨盆的耻骨抽出，并且从其分离出骨髓MSCs。将MSCs培 养在低葡萄糖基石出培养基(Dulbecco' s modified Eagle' smedium with low glucose, DMEM-LG)中，其包含10%胎牛血清，在37°C、5%C02与95%的潮湿气体下培养。培养基 1周更换2次。细胞以胰蛋白酶处理后，以每周1 3的比例传代培养，接着收集并包入 PorcogenTM胶原蛋白溶液中(3%第一型/第三型胶原蛋白，双美生物科技，台湾)，其仅含 无血清的DMEM-LG。细胞以0. 5mL等分培养，最终细胞密度为2. 6 X IO6细胞/cm2，在37°C、1 小时胶化于24-孔培养盘内，接着每孔加入2. OmL的培养基，其包含无血清DMEM-LG含ITS+ 预混剂、50 μ g/mL-抗坏血酸-2-磷酸、10-7M 糖皮质固醇、10ng/mL TGF- β 1 (Pepro Tech ； Rocky Hill, NJ) 0细胞培养在前述培养基中7至21天，培养基每3天更换，让细胞分散于 富含胶原蛋白的培养基中以获得一基质，其为含有胶原蛋白及类软骨细胞的混合液。在细 胞接种后7、14及21天分析细胞/胶原蛋白的混合液，确认已分泌GAG且骨陷窝尚未形成， 以获得细胞-基质复合物。实例2 细胞-基质复合物的特征将取得的细胞-基质复合物包入石蜡并且切成5 μ m切片。将这些切片去除石蜡并 且复水，透过连续浸泡在100%二甲苯、100%酒精、70%酒精与水。样本切片用苏木紫-伊 红染色(Mut0，T0ky0，日本)来评估细胞形态。另外，用爱尔新蓝染色(Sigma)来评估糖胺 聚多糖(GAG)含量。实例3 人类患者的研究1.患者族群选择之患者带有来自剥脱性骨软骨炎或内侧股骨髁之骨坏死的软骨或从骨软骨 炎，或体重支撑区域骨关节炎之局部性软骨损伤。然而，患者带有未成熟骨，严重性退化关 节炎而必须进行人工关节置换，其它损伤如十字韧带断裂和半月板受伤，关节炎(如类风 湿性关节炎和痛风性关节炎)，与感染性疾病(如AIDS和B型肝炎)；患者完全地卧床3个 月以上；患者长期施用皮质类固醇超过两周并且非酒精中毒者，则排除在外。总共招募10 位患者。其中，6位是女性，4位是男性。患者平均年龄为66岁(范围从47到83岁)。2.手术于膝盖上施以前正中切开术并且使用内侧髌骨切开术使内侧股骨髁之关节表面 露出。膝盖极度地弯曲，让进入骨软骨损伤变得容易。清除骨损伤并填满从上部胫骨取得 的海绵状骨。然后，将从实例ι得到的细胞-基质复合物当作手术的移植物移植到损伤处 上。最后，从近端胫骨取得骨膜用来覆盖手术移植物。术后，所有患者接受规律的四头肌训 练与练习来改善膝盖的运动范围。3.临床评估所有10位患者膝盖功能通过国际膝部档委员会主观膝部评分表(InternationalKnee Documentation Committee Subjective Knee Form, IKDC)进行评分，并进行 X 光检 查，包括术前及1.5、3、6和12个月的术后追踪。在术后6个月与12个月实施核磁共振造 影术(MagneticResonance Imaging，MRI)。在术后12个月实施关节内视镜检与组织切片， 若病患接受此建议的话。学生t检定用于统计分析。4.结果除了一位患者于术后6个月不愿回来评估，其余9位患者术后定期地追踪至12个 月。如图1所示，依本发明方法处理后，患者的IKDC分数经由学生t检定后发现，术后6个 月与12个月有显著改善。所有9位患者在术后6个月觉得好多了。4位患者术后追踪超过 12个月并且其中3位接受关节内视镜检查。发现在软骨损伤处的透明软骨带有中度硬度， 密合而无任何空隙在移植处与移植物之间(见图2)。综上，包括类软骨细胞的细胞基质复合物会分泌GAG，但不具骨陷窝(Iacuna)，且 依本发明所制备的基质，在患者的软骨损伤修复显示出极好的功效，当移植到受移植处后， 该处形成透明软骨而且在移植处与由细胞-基质制作的手术移植物之间无任何空隙。
权利要求
1.一种制备用于修复软骨损伤之移植物的方法，其特征在于其包括提供间质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)；以及将该MSCs培养于含胶原蛋白之培养基，其添加转化生长因子-β 1 (Transforming growth factor beta one, TGF-β 1)，条件为容许该MSCs之分化成为类软骨细胞及移植物 之形成。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于该培养步骤由以下达成将该MSCs培养于 含胶原蛋白之培养基，其添加TGF-β 1，达7至21天，条件为容许胶原蛋白基质之形成及该 MSCs分化成为类软骨细胞，该类软骨细胞包于胶原蛋白基质中。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于该MSCs从骨髓、脂肪组织、肌肉组织、脱落乳 牙的牙髓、脐带血、瓦顿氏凝胶(Wharton’ s jelly)、胎盘或脐带内膜中被分离出来。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于该胶原蛋白包含在培养基中的浓度为约 至约 10% (w/v)。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于该胶原蛋白包含在培养基中的浓度为约3% (w/ν)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于该培养基包含第一型或第二型胶原蛋白。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于更进一步的包含，在培养步骤后，确认其类软 骨细胞分泌糖胺聚多糖且该移植物不具骨陷窝(lacuna)。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于该培养步骤在胶囊中进行。
9.一种用于修复软骨损伤之移植物，其特征在于其经由权利要求1至8之任一项制备 而成。
10.如权利要求9所述之移植物，其特征在于该类软骨细胞分泌糖胺聚多糖并且该移 植物不具骨陷窝(lacuna)。
全文摘要
本发明关于一种包有类软骨细胞的胶原蛋白基质之移植物，其修复软骨损伤之用途及制备该移植物之方法。
文档编号C12N5/0789GK102145195SQ201110034680
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月30日 优先权日2010年2月4日
发明者刘华昌, 李幸懋, 林峯辉, 颜君哲 申请人:刘华昌, 李幸懋, 林峯辉, 颜君哲