专利名称：SmDXS和SmGGPPS双基因共转化提高丹参酮含量的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体说，是涉及一种利用代谢工程策略，用双关键酶基因共转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。
背景技术：
心脑血管疾病是目前对人类威胁最大的三大类疾病之一，且是位于这三大疾病之首。据统计，全世界每年大约有1700万人死于心脑血管疾病，约占全球总死亡人数的1/3 ； 我国每年大约有260万人死于心脑血管疾病，心脑血管疾病已成为威胁全人类健康与生命的“头号杀手”。因此积极研究及开发高效、低毒和廉价的治疗心脑血管疾病的临床药物对提高人类健康水平具有十分深远的意义。丹参又名紫丹参、红根、赤参、活血参等，为唇形科鼠尾草属植物丹参(Savia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎。丹参作为一种传统中药材在我国沿用已久，始载于《神农本草经》，是一种主治心血管系统疾病的常用中药。丹参药用成分主要包含两类一类是以丹参酮类化合物为代表的脂溶性二萜类化合物，另一类是水溶性的多聚酚酸类化合物。在临床应用方面，丹参酮类化合物不仅具有天然抗氧化作用、抗动脉粥样硬化、降低心肌耗氧量等心血管药理作用及抗菌消炎作用，而且具有明显的抗肿瘤作用。由于可以治疗上述多种疾病，丹参在国内外市场上的需求量一直很大；又因为栽培丹参的生长周期长且有效成分含量低，给临床使用和质量控制带来一定困难；另一方面， 虽然我国的药用植物资源十分丰富，但传统的中草药提取方法会消耗大量的野生资源，当采集和消耗量超过自然资源的再生能力时，必然会导致物种的濒危甚至灭绝，而且加上自然环境的日益恶化，也进一步导致了药用植物的资源匮乏。因此，如何使得丹参这一原料药材的供应在数量和质量上能更好地满足临床应用的需求成了研究热点。由于丹参的生长周期很长O年以上)，野生资源的匮乏，而在人工栽培下又面临着种质退化等问题；采用化学合成等方法，又面临着高成本、高污染、工艺流程复杂等问题；而组织培养技术产生的丹参毛状根、再生植株等药用活性成分的积累量还达不到商业开发利用的要求。因此，利用基因工程手段，将丹参酮合成途径中的两个或多个关键酶基因导入丹参中高效表达，获得丹参酮高产的转基因发根或再生植株，再结合离体培养的方法，进行大规模的生产和培养，可望从根本上缩短种植周期、提高丹参药用活性成分和解决丹参的药源问题。据文献检索分析，1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(SmDXS)和栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合酶基因(SmGGPPQ是丹参酮生物合成途径中的两个关键限速酶基因，是丹参酮代谢工程的重要靶点。1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXQ是1-脱氧-D-木酮糖-5磷酸 (DXP)途径中的第一个关键酶，而DXP途径是丹参酮生物合成途径的重要来源之一，因此， SmDXS是丹参酮生物合成途径的关键酶基因。栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)催化15碳的法呢基焦磷酸(FPP)与另一个5碳分子异戊烯基焦磷酸(IPP)可合成20碳的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸(GGPP)，GGPP是二萜类物质(包括丹参酮和青蒿素等)的生物合成的关键前体物质。因此，这一步也是利用基因工程技术来调控丹参酮生物合成的关键切入点。采用基因工程手段，将上述的两个关键酶基因SmDXS和SmGGPPS共转化丹参，将打破丹参酮生物合成途径的瓶颈效应，获得高产丹参酮的丹参毛状根或植株，为商业化生产丹参酮提供新型优质药源。因此，本发明在实际解决丹参酮药源紧缺性的问题上具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服常规技术中的不足，提供一种有效提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。本发明还提供了实现上述方法的重组载体。本发明是通过以下技术方案实现，双基因共转化提高丹参酮含量的方法，包括以下步骤(1)将1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(SmDXS基因，GenBank :FJ643618. 1)和栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶基因(SmGGPPS基因，GenBank :FJ643617. 1)插入植物表达载体，构建重组载体；所述的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因和栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶基因序列分别为SEQ ID :1禾口 SEQ ID 2的DNA序列；植物表达载体可选用pCAMBIA质粒或pBI质粒，尤其是pCAMBIA1304质粒；(2)将步骤(1)所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；发根农杆菌可选用发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株A4或发根农杆菌菌株L BA9402 ；(3)用步骤( 所得含有重组载体的发根农杆菌介导1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因和栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶基因转化丹参，获取毛状根可将含有重组载体的发根农杆菌与丹参外植体(如幼嫩叶片)共培养，长出毛状根后除菌；(4)检测步骤C3)毛状根中的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因和栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根；检测方法为PCR 及 Southern blotting 检测。本发明从丹参中克隆丹参酮生物合成途径中的关键酶基因SmDXS和SmGGPPS基因，将这两种基因可操作性地连于表达调控序列，构建含上述两种cDNA分子的植物表达载体并转化发根农杆菌；以发根农杆菌为介导，将SmDXS和SmGGPPS基因同时导入丹参细胞中并获得毛状根。通过PCR和Southern blotting检测目的基因SmDXS和SmGGPPS的整合情况，获得阳性的转基因毛状根株系。半定量RT-PCR分析插入目的基因SmDXS和SmGGPPS在毛状根中的表达情况，测定转基因丹参毛状根中SmDXS和SmGGPPS的酶活力，高效液相色谱测定转基因毛状根中丹参酮含量，DPPH清除自由基法测定转基因毛状根中总丹参酮的抗氧化活性。结果显示，SmDXS 和SmGGPPS在转基因毛状根中表达均有提高，转基因毛状根中丹参酮含量比非转基因有显著提高；转基因毛状根中的单位丹参酮的抗氧化能力和对照相当。所述的PCR检测中，分别在植物表达载体上启动插入基因(SmDXS，SmGGPPS)表达的组成型表达启动子CaMV35S的内部及插入基因的内部设计上游及下游特异性引物进行 DNA的PCR扩增，紫外线下观察到目的条带的株系即为阳性转基因毛状根株系。
所述的半定量RT-PCR测定丹参转基因毛状根中SmDXS和SmGGPPS基因的表达情况的方法为提取经PCR检测为阳性的转基因毛状根株系的RNA，将相同量的总RNA反转成 cDNA第一链，分别设计插入目的基因及管家基因ISSrRNA的引物，以等量上述cDNA第一链体系为模板进行半定量RT-PCR扩增，分析SmDXS和SmGGPPS基因的表达量。本发明所提供的双基因共转化策略提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，采用基因工程手段将双关键酶基因(SmDXS和SmGGPPQ导入丹参毛状根细胞中，获得了高产丹参酮的丹参毛状根株系。实验结果显示，共转SmDXS和SmGGPPS基因的毛状根中所检测的丹参酮(隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮II A)含量显著高于对照组。可在实际解决丹参酮药源紧缺性的问题上具有十分重要的意义。本发明的方法为丹参毛状根商业化生产奠定坚实的基础，也为生产具重要临床需求的丹参酮提供了一种新型优质药源，对缓解丹参酮药源的紧缺性起到积极的促进作用。
图1为基因丹参毛状根中SmDXS和SmGGPPS基因的PCR检测结果。M为 DL-2000Marker(100 2000bp) ；PC 为阳性对照(pCAMBIA1304+-SmDXS_SmGGPPS 质粒)；NC 为阴性对照(野生型丹参)；BC为空对照(PCAMBIA1304+质粒遗传转化丹参获得的毛状根)；DG5、DGlU DG16、DG26和DG32为SmDXS和SmGGPPS双基因共转化丹参获得的不同转
基因株系。图2为转基因丹参毛状根RT-PCR检测结果。SmDXSA和SmDXSB分别代表总SmDXS 及内源SmDXS基因的表达；SmGGPPS A和SmGGPPS B分别代表总SmGGPPS及内源SmGGPPS基因的表达；18S rRNA基因作为内参。BC为空对照(pCAMBIA1304+质粒遗传转化获得的丹参毛状根)；DG5、DGl 1、DG13、DG16和DG32为SmDXS和SmGGPPS双基因遗传转化丹参获得的不同转基因株系。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 《分子克隆实验室手册》(New York =Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1丹参SmDXS和SmGGPPS基因的克隆1.丹参总RNA的分离提取及cDNA第一链的合成取鲜重量为0. Ig左右的转基因毛状根用研钵研碎，加入盛有裂解液的1. 5mL EP 管，充分振荡后，参照TIANGEN公司提供的RNApr印pure plant kit说明书提取转丹参基因毛状根总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA纯度及浓度。分别以0.5yg RNA为起始量，用反转录酶XL(AMV)进行第一链cDNA的合成(操作步骤参照Promega公司提供的相关说明书)。
2. SmDXS和SmGGPPS编码序列特异引物的设计及目的基因片段的获得根据所述SmDXS基因的编码序列(SEQ ID NO. 1)和SmGGPPS基因的编码序列(SEQ ID N0.2)，分别设计扩增出完整编码框的上下游特异引物(SmDXSKF 5 > ATGGCGTCGTCTTGTGGAGTA > 3，SmDXSKR 5 > TTACAAGTTGTTGATGAGATGA > 3 ； SmGGPPS KF5 > ATGAGATCTATGAATCTGGTGG > 3，SMGGPPS KR 5 > TTAGTTCTGCCTATGTGCAATG > 3)，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建植物表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。测序结果表明，所克隆的序列与我们实验室在GenBank上登录的丹参SmDXS基因(SEQ IDN0. 1)和SmGGPPS基因(SEQ ID NO. 2)的编码序列完全一致。PCR反应体系如下MilliQ 超纯水15. 75 μ 1dNTP (2mM)2. 5 μ 10 X PCR Buffer (Mg2+-)2. 5 μ 1Mg2+1. 5μ 1F (上游引物)Ιμ R (下游引物)Ιμ 模板0. 5 μ 1Taq 酶0. 25 μ 1总体积25 μ 1PCR 反应条件:94°C 10min，35 个循环(94°C变性 45sec，55°C退火 60sec，72°C延伸 150sec)，72°C IOmin0实施例2 :含丹参SmDXS及SmGGPPS基因的植物表达载体的构建1.中间载体pCAMBIA1304+的构建以pBI121和pCAMBIA1304为材料，构建植物表达载体pCAMBIA1304+。具体步骤如下HindIII/EcoRI 双酶切 pBI121 和 pCAMBIA1304 ；回收pBI121_GUS表达盒及pCAMBIA1304 大片段；连接转化，挑取单克隆菌落抽提质粒酶切及测序验证。结果表明，植物表达载体 pCAMBIA1304+ 构建成功。2.植物表达载体pCAMBIA1304+-SmDXS的构建用从丹参中克隆到的SmDXS基因替换上述构建成功的pCAMBIA1304+上的⑶S-GFP 基因。具体步骤如下，Bgl II/BstE II 双酶切 pMD18T-SmDXS 和 pCAMBIA1304+;回收 SmDXS 基因和PCAMBIA1304+大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，SmDXS基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304+中，从而获得含SmDXS基因的植物表达载体pCAMBIA1304+-SmDXS。3.植物表达载体 pCAMBIA1304+-SmGGPPS 的构建用从丹参中克隆到的SmGGPPS基因替换上述构建成功的pCAMBIA1304+上的⑶S基因。具体步骤如下,BamHI/SacI 双酶切 pMD18T_SmGGPPS 和 pCAMBIA1304+ ；回收 SmGGPPS 基因和PCAMBIA1304+大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，SmGGPPS基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304+中，从而获得含SmGGPPS基因的植物表达载体pCAMBIA1304+-SmGGPPS。
4.植物表达载体 pCAMBIA1304+-SmDXS-SmGGPPS 的构建以上述的pCAMBIA1304+-SmGGPPS为基础，用从丹参中克隆的SmDXS基因替换 pCAMBIA1304+-SmGGPPS 上的 GFP+GUS 基因。具体地，Bglll/BstEII 双酶切 pMD18T_SmDXS 和 pCAMBIA1304+-SmGGPPS ；回收 SmDXS 基因及 pCAMBIA1304+_SmGGPPS 大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，SmDXS基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304+-SmGGPPS中，从而获得含SmDXS和SmGGPPS的植物表达载体 pCAMBIA1304+-SmDXS-SmGGPPS。通过上述方法，将丹参酮生物合成途径关键酶基因SmDXS和SmGGPPS可操作性地连于表达调控序列，形成含SmDXS和SmGGPPS基因的植物表达载体pCAMBIA1304+_SmDXS， pCAMBIA1304+-SmGGPPS, pCAMBIA1304+-SmDXS-SmGGPPS，该重组表达载体可用于通过代谢工
程策略来提高丹参中丹参酮含量。实施例3 发根农杆菌介导SmDXS和SmGGPPS基因遗传转化丹参获得转基因毛状根1.含植物表达载体 pCAMBIA1304+-SmDXS，pCAMBIA1304+_SmGGPPS， pCAMBIA1304+-SmDXS-SmGGPPS发根农杆菌工程菌的获得将实施例2中含SmDXS和SmGGPPS基因的植物双价表达载体pCAMBIA1304+_SmDXS， pCAMBIA1304+-SmGGPPS,pCAMBIA1304+-SmDXS-SmGGPPS 分别转入发根农杆菌 C58C1 中，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含SmDXS和SmGGPPS基因的上述植物表达载体已分布成功导入到发根农杆菌菌株C58C1中。2.发根农杆菌介导SmDXS，SmGGPPS基因遗传转化丹参(1)外植体的预培养选取培养一个月左右的丹参无菌苗，将幼嫩叶片剪成0. 5X0. 5cm2的小块，转入预培养培养基(MQ上，25°C暗培养2d。(2)农杆菌与外植体的共培养将预培养材料放入活化好的稀释菌液(1/2MS液体稀释)中，轻轻摇晃使外植体与菌液充分接触浸泡10分钟。取出外植体用无菌滤纸吸去菌液，转到共培养培养基1/2MS中， 暗培养3-4d。(3)毛状根的除菌和继代培养将上述的共培养3-4d的丹参外植体转接到除菌固体培养基(1/2MS+Cef500mg/L) 中，25°C暗培养，每10天更换一次培养基，2-3周左右，可从外植体伤口处长出毛状根。将已发根的丹参外植体转接到除菌固体培养基(1/2MS+Cef 300mg/L)上，25°C暗培养，待毛状根长至3cm以上时剪取单一毛状根作为一个无性系，继续接种于除菌培养基(1/2MS+Cef 100mg/L)中暗培养两周，直至无农杆菌溢出。3.转基因丹参毛状根的PCR及Southern blotting检测(1)转基因毛状根基因组DNA的提取本发明采用CTAB法提取转基因毛状根基因组DNA。剪取上述除菌完毕的转基因毛状根5cm左右放入1. 5ml离心管中，加入适量的石英砂及600 μ 1 CTAB裂解液(65°C预热，含β巯基乙醇)，用研磨棒将材料充分磨碎。置于65°C水浴锅中40-50分钟，其间多次混勻样品(次/lOmin)，冷却至室温后加入等入体积的苯酚，轻轻颠倒混勻乳化lOmin，12000rpm离心20min，小心吸取上清于新EP管中，加入等体积苯酚/氯仿(1 1)，轻轻混勻，12000rpm离心20min，缓慢吸取上清于新EP管中，加等体积的氯仿混勻，12000rpm离心 20min，缓慢吸取上清于新EP管中，加2倍体积预冷的无水乙醇，析出沉淀。用枪头将沉淀挑到新EP管中，加入75%乙醇4°C洗涤过夜。次日用75%乙醇再洗涤两次，吸出上清，室温晾干，加入30-50 μ 1水溶解沉淀，用RNA酶处理后于_80°C超低温冰箱冻存，备用。(2)弓丨物设计及PCR检测在pCAMBIA1304+-SmDXS-SmGGPPS上启动插入目的基因表达的组成型表达启动子 CaMV35S及插入基因上分别设计特异性上游及下游引物用于DXS基因检测的引物为35S1 304F5 ’ -GAGGACCTAACAGAACTCGCC-3 ’ 和 DXS197R5 ’ -GGAAGAGTAGCAGTAGTGCGA-3，.用于 GGPPS 基因检测的引物为!35S121F 5，-GAGGACCTAACAGAACTCGCC-3 和 GGPPS161R5，_ATGAATCCGACC AGGGATTTGGAGGGGCAT-3’。用PCR方法扩增，并对上述毛状根的总DNA进行分子检测，紫外线下观察到目的条带的株系即为阳性转基因毛状根株系，如图1所示。其中，结果表明，利用上述特异引物，在一部分转基因毛状根中能检测到和阳性对照 (PCAMBIA1304+-SmDXS-SmGGPPS质粒为模板)大小相当的PCR产物。而以空发根菌株遗传转化丹参所发出的毛状根及野生型丹参植株根的基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。结果初步说明SmDXS，SmGGPPS基因已经整合到丹参基因组中。(3)转基因丹参毛状根的Southern blot检测用CTAB法提取PCR结果为阳性的发根系及空发根菌株侵染获得的发根的基因组 DNA,用BamHI过夜酶切30 μ g基因组DNA，酶切产物通过0. 8%琼脂糖凝胶电泳后转到尼龙膜上，用地高辛(DIG)-标记的探针在42°C进行过夜杂交，然后进行洗膜，最好X光片曝光 16小时(具体参照分子克隆手册上描述的方法)。Southern blot结果表明随机选择的6 个PCR结果为阳性的丹参发根系中有5个具有杂交信号，基因拷贝数为1-3个，表明外源基因已经成功整合到丹参基因组中。本实施例将所述的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的含SmDXS 和SmGGPPS基因植物表达载体的发根农杆菌菌株C58C1，利用所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参细胞，获得经PCR及Southern blot检测为阳性克隆的转基因毛状根。转基因丹参毛状根的获得为筛选获得高产丹参酮的毛状根提供了直接素材。实施例4 半定量RT-PCR检测转基因丹参毛状根中SmDXS和SmGGPPS基因的表达1.毛状根的液体培养选择实施例3中生长快、分枝好且分子检测为阳性的丹参毛状根，在超净工作台上剪取2 3cm毛状根，用无菌蒸馏水冲洗掉其表面上的琼脂后接入装有200ml 1/2MS液体培养基的培养瓶中100rpm，25°C黑暗下培养，每20天更换新鲜1/2MS液体培养基继代一次，80天后收获，取适量新鲜毛状根用吸水纸吸干表面水分后，用锡箔纸包好浸入液氮中冷冻后保存于-80 °C用于RNA提取，其余毛状根烘干后用于丹参酮含量提取。2.引物的设计和合成根据丹参酮生物合成代谢途径关键酶基因SmDXS和SmGGPPS的编码序列分别设计引物用于检测丹参毛状根中总的SmDXS和SmGGPPS基因的表达情况(SmDXS，SmGGPPS皆为丹参内源基因)，而通过在SmDXS和SmGGPPS的3’编码序列分别设计一个下游引物和目的基因上的上游引物配对则可以检测内源基因的表达情况(转入的外源基因仅是基因的编码框序列，不带有5’及3’非编码序列)，管家基因18S rRNA用来作为内参。所用引物由上海生工生物工程公司合成。3. RNA的提取及cDNA第一链的合成方法同实施例1的步骤1。4.半定量RT-PCR检测SmDXS，SmGGPPS及管家基因18S rRNA基因的表达以相同量(1μ 1)的上述cDNA第一链为模板，分别用上述设计的引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下MilliQ 超纯水16. 25 μ 1dNTP (2mM)2. 5 μ 110 X Buffer (Mg2+)2. 5 μ 1Mg2+1. 5μ 1F (上游引物)0·5μ1R (下游引物)0·5μ1模板1 μ 1Taq 酶(5u/ μ 1)0. 25 μ 1总体积25 μ 1PCR 反应条件94°C 10minJ8 个循环(94°C变性 45sec，58°C退火 60sec，72°C延伸 100sec),72°C IOmin0管家基因18S rRNA基因检测的PCR反应条件中将循环数改为20即可。结果显示，SmDXS和SmGGPPS基因在转入相应基因的毛状根克隆中都过量表达且都强于其在对照组中的表达，但不同克隆之间的表达量有一定的差异(图2)。本实施例采用半定量RT-PCR技术测定转基因丹参毛状根中SmDXS，SmGGPPS基因的表达情况，为分析SmDXS和SmGGPPS基因在丹参酮合成过程中所起的作用提供一定的依据。实施例5 转基因丹参毛状根中SmDXS和SmGGPPS的酶活力检测对经半定量RT-PCR扩增分析为SmDXS和SmGGPPS基因的表达量高的转基因毛状根株系进行SmDXS和SmGGPPS的酶活力测定。1.毛状根的总蛋白的提取提取转基因与非转基因毛状根的总蛋白约Ig新鲜(FW)发根组织加入3ml Extract buffer (PH7. 5,50mM Tris-HCl，IOmM 巯基乙醇，1 %聚乙烯吡咯烷酮(PVP))。用玻璃勻浆器勻浆(冰上操作)，至充分裂解。充分裂解后，10, 000-14, OOOg 4°C离心3-5min， 取上清，即可进行后续的酶活力分析。2. DXS活力的测定按Ge等(Plant Science 2005,168 :487-491)的方法对丹参发根中的1_脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶进行酶活力的测定。(1)按每毫升反应体系中含有50mg蛋白的标准，把酶提取物加入酶活反应体系中，反应体系包括40mM Tris-HCl (pH 7. 5)，2. 5mM MgCl2, 5mM巯基乙醇，ImM 二磷酸硫胺， IOmM丙酮酸钠和20mM ofD-甘油醛-三磷酸。(2)反应液放于37°C温浴Ih，然后80°C 5min终止反应。(3) 13. OOOrpm 5min 除去变性蛋白。
(4)上清与Iml IOmM 3，5_ 二氨基苯甲酸混合(含有5M磷酸)后，沸水浴加热 15min。(5)荧光检测使用PerkinElmer LS50B荧光光度计，检测条件为396nm激发， 5 IOnm发射。结果表明，转基因发根中的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶的酶活性都明显提高， 都强于其在对照组中的酶活，DXS酶活平均提高了 1. 8倍，但不同克隆之间有一定的差异。3. GGPPS活力的测定按Hefner 等(Arch Biochem Biophys. 1998,360 :62-74)的方法对丹参发根中的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶进行酶活力的测定。(1)按每毫升反应体系中含有20mg蛋白的量，把酶提取物加入酶活反应体系中， 反应体系包括50mM Tris-HCKpH 7. 6), IOmM MgCl2, 5mM DTT，0. ImM原钒酸盐，10% (V/V) 甘油。(2)在反应液中加入50mM法尼基二磷酸转移酶(该酶可以有效的催化DMAPP和 GPP)和wC标记的异戊烯焦磷酸(IPP)后，31°C孵育20min。(3)加入甲醇=HCl (4 1V/V)终止反应。(4)GC-MS检测酶活力=Shimadzu model GC-7A气相色谱仪，柱温 150°C，流速 lml/
mirio结果表明，转基因发根中的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶的酶活性都明显提高，都强于其在对照组中的酶活，GGPPS酶活平均提高了 2. 3倍，但不同克隆之间有一定的差异。本实施例通过比较测定转基因毛状根和非转基因毛状根中两种酶的活力，表明转基因丹参毛状根中酶活力高于非转基因毛状根中酶活力。实施例6 利用HPLC测定转基因丹参毛状根中丹参酮含量对经PCR检测为阳性的转基因毛状根株系中丹参酮的含量进行高效液相色谱测定。1.色谱条件及标准品贮备液的配制色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈水(65 35)，检测波长270nm，柱温 30°C，流速 lml/min，进样量 20μ 1。精密称取隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮II A标准品分别配置成浓度为36μ g/ml， 36 μ g/ml, 22 μ g/ml标准品贮备液，保存于_20°C备用。2.标准曲线的制作本发明中流动相乙腈水在体积比65 35时，隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮IIA的保留时间分别为18. 90min,20. 53min和34. OOmin，三种丹参酮成分完全分离，且峰型良好。 将上述标准品贮备液品分别取5ul，10ul,20ul,30ul,40ul在相应色谱条件下进样，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品浓度(X，μ g/ml)进行回归分析。3.转基因毛状根丹参酮含量的提取及测定将实例4中收获并烘干的转基因丹参毛状根放入研钵中充分研磨，取200mg毛状根干粉加入甲醇二氯甲烷(3 1^八)161111，超声提取601^11，室温放置过夜，次日拿出离心(12000rpm，10min)，吸取上清萃取液真空干燥，残余物重新用Iml的色谱甲醇二氯甲
10烷(3 1)混合液体溶解，样品用0.22μΜ的滤膜过滤后各取20μ1，注入高效液相色谱仪， 记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品丹参酮含量。在本发明中对照组毛状根中总丹参酮的平均含量为0. 496mg/gDff,单转SmDXS基因的毛状根中总丹参酮的平均含量为1.437mg/g dw，单转SmGGPPS基因的毛状根中总丹参酮的平均含量为1. 682mg/g dw,而共转SmDXS及SmGGPPS基因的毛状根中所检测的3种丹参酮(隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮IIA)含量比对照组及转单基因组显著提高。共转SmDXS 及SmGGPPS基因的丹参转基因毛状根总丹参酮的平均含量为2. 163mg/g DW，分别是对照组毛状根，单转SmDXS基因及单转SmGGPPS的4. 36，1. 50及1. 29倍。在所测试的共转SmDXS 和SmGGPPS基因丹参毛状根株系中，16号克隆(DG16)丹参酮含量最高(3. 124mg/g DW)，达到对照组的6. 29倍。本实施例采用HPLC法测定了转基因丹参毛状根中丹参酮含量，结果表明共转 SmDXS和SmGGPPS基因的丹参毛状根总丹参酮含量比对照组显著提高，进而证明通过本发明的方法获得高产丹参酮的丹参毛状根的策略是高效可行的。实施例7 =DPPH清除自由基法测定转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性1.样品溶液制备根据所测样品浓度通过计算将样品稀释成一定浓度梯度(0. 25μ g/ml，0. 5μ g/ ml,lyg/ml,2yg/ml,4yg/ml)的甲醇溶液各lml，然后加入Iml DPPH(1，1-二苯基苦基苯胼)溶液(0. 2mM的甲醇溶液)作为自由基来源，并在室温(25°C)下保温30min。2.样品的吸光度测定及DPPH自由基清除活性的换算将步骤1中的样品分别在分光光度计下517nm测定并记录其吸收值，根据下面的公式将吸光度值转换成DPPH自由基清除活性DPPH自由基清除活性(％ ) = [(AO-Al)/ AO X100]AO是对照样品吸光度值Al是样品或标准品吸光度值3. DPPH自由基清除活性能力的比较IC50为50%抑制浓度即清除该样品中一半的DPPH自由基所需该样品中活性成分的浓度，半数抑制是用来衡量样品中活性成分灵敏度的，半数抑制越低，说明其灵敏度越高，清除DPPH自由基能力越强，抗氧化能力亦越强。结果表明此步骤根据所得DPPH自由基清除活性所计算出样品DG16及对照组的 IC50分别为0. 3108,0. 3109μ g/ml，差异不明显。而样品DG16的总丹参酮含量比对照组高的多(约6.四倍)，因此样品DG16丹参酮的总抗氧化活性显著高于对照组。本实施例通过实验来证明通过转基因方法获得的丹参毛状根中的单位丹参酮的抗氧化能力和对照相当，进而证明通过本发明的方法获得高产丹参酮的丹参毛状根的策略是高效可行的。实施例中的植物表达载体pCAMBIA1304还可以用pCAMBIA系列其他种类及pBI系列替代，或者发根农杆菌菌株C58C1用A4或LBA9402菌株代替，效果相同。本发明采用共转SmDXS和SmGGPPS基因的代谢工程策略获得高产丹参酮的丹参转基因毛状根株系，为规模化生产丹参酮，缓解丹参酮的药源紧缺性问题提供一种新型有效方法。
权利要求
1.SmDXS和SmGGPPS双基因共转化提高丹参酮含量的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因SmDXS和栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶基因SmGGPPS插入植物表达载体，构建重组载体；所述的1-脱氧木酮糖_5_磷酸合成酶基因和栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶基因序列分别为SEQ ID 1和SEQ ID 2的DNA序列；(2)将步骤(1)所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；(3)用步骤( 所得含有重组载体的发根农杆菌介导1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因和栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶基因转化丹参，获取毛状根；(4)检测步骤C3)毛状根中的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因和栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根。
2.权利要求1所述SmDXS和SmGGPPS双基因共转化提高丹参酮含量的方法，其特征在于，步骤(1)所述的植物表达载体为pCAMBIA质粒或pBI质粒。
3.权利要求1所述SmDXS和SmGGPPS双基因共转化提高丹参酮含量的方法，其特征在于，步骤( 所述发根农杆菌为发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株A4或发根农杆菌菌株 L BA9402。
4.权利要求1所述SmDXS和SmGGPPS双基因共转化提高丹参酮含量的方法，其特征在于，步骤C3)中，用所述步骤( 所得含有重组载体的发根农杆菌介导1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因和栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶基因转化丹参幼嫩叶片，获取毛状根
5.权利要求1所述SmDXS和SmGGPPS双基因共转化提高丹参酮含量的方法，其特征在于，步骤(4)所述检测1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因和栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶基因的方法为PCR及Southern blotting检测。
6.一种用于提高丹参酮含量的重组载体，其特征在于，含有1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因和栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶基因。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，是一种提高丹参酮含量的方法，用丹参1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(SmDXS)和丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(SmGGPPS)基因构建成SmDXS和SmGGPPS基因的植物双价高效表达载体，遗传转化丹参叶片获得转SmDXS和SmGGPPS基因的丹参毛状根。本发明获得的转基因丹参毛状根中丹参酮含量显著提高，其中一个株系的总丹参酮含量为对照的6.29倍。本发明提供了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，也为生产具重要临床需求的丹参酮提供了一种新型优质原料。
文档编号C12N15/82GK102174563SQ201110034229
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月31日 优先权日2011年1月31日
发明者周聪聪, 开国银, 张昂, 郭莺莺, 陈莹, 鞠冠华 申请人:上海师范大学