专利名称：AaPMT和AaTRI双基因共转化提高三分三毛状根中托品烷生物碱含量的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的方法，特别是一种利用双关键酶基因共转化代谢工程策略提高三分三毛状根中托品烷生物碱含量的方法。
背景技术：
托品烷生物碱(tropane alkaloids)，又称莨菪烷生物碱，包括莨菪碱(hyoscyamine) > 山直菪碱(anisodamine)东直菪碱(scopolamine)、禾口樟柳碱 (anisodine)。托品烷生物碱的临床各科应用越来越广泛，它是一类作用于副交感神经系统的抗胆碱药，具有麻醉、解痉、止痛、抗休克的功能。此外，它还具有改善微循环的作用，临床可用于治疗微循环障碍性疾病；还可用来治疗青光眼等。山莨菪碱和樟柳碱除了作用域副交感神经系统。在大鼠中，还对油酸所引起的急性肺损伤和急性肾衰时肾微血管的损伤具有保护作用。但是，由于资源植物体内托品烷生物碱的产量非常低，其供给量远远不能满足药用市场的需求。尤其是东莨菪碱，由于其对中枢镇静比较强，在商用市场中，对东莨菪碱的需求量是莨菪碱的10倍，但在资源植物中东莨菪碱的含量又远比莨菪碱低，所以东莨菪碱的价格远高于莨菪碱(高10倍多)。野生资源植物有限，过度开采容易造成生态失衡。多年来，世界各国科学家围绕着如何扩大托品烷生物碱的药源问题进行了大量研究。目前，莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱和樟柳碱均可以通过化学方法合成，但化学合成的方法存在工艺流程复杂、成本高及易造成环境污染等问题；传统育种方法所需的周期太长；细胞培养则存在托品烷生物碱含量低微及稳定性差等问题。但是毛状根技术在近些年成为了生产植物次生代谢物的一种比较新的途径。通过发根农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染植物而生成的毛状根具有很多优点比如毛状根具有药用植物遗传背景，所以具有相似的代谢特征，能够稳定生产次生代谢物，有时甚至比植株本身的含量更高；同时毛状根生长速度快，不需外源激素，在连续继代培养的情况下能保持遗传性稳定。毛状根的可以通过生物反应器进行大规模的培养；还可以再生为完整的植株，由发根再生的植株同样具有遗传稳定性。药用植物三分三(Anisodus acutangulus)，为茄科多年生草本植物，主要分布于我国云南西北部丽江。通过高效液相色谱检测，其根部含有大量的托品烷生物碱，据报道野生三分三干燥品总生物碱含量高达1. 2%，所含生物碱含量比世界上一些常用的茄科植物如颠茄、莨菪曼陀罗等均高的多，且三分三所含生物碱绝大部分是莨菪烷类生物碱。三分三作为解痉镇痛的中草药在云南民间使用已有三四百年的悠久历史，然而由于大量采摘，野生资源已十分匮乏。因此，三分三是一种既重要又匮乏的产莨菪烷生物碱的优质资源植物。目前，莨菪生物碱的基本代谢途径已经研究得比较清楚。与其他产莨菪烷生物碱植物如莨菪等相似，三分三中的莨菪碱也是由精氨酸和鸟氨酸经腐胺(Putrescine) 衍生而来的。在整个莨菪烷生物碱合成过程中，腐胺N-甲基转移酶(Putrescine N-methyltransferase,PMT)禾口托品丽还原醇 I (Tropinone reductase I,TRI)是两个关键的催化酶，是托品烷生物碱代谢工程的重要靶点。它们通过一系列的催化作用最终生成莨菪醇，使得莨菪醇沿主路途径最终生成目标活性物质莨菪生物碱。将上述的两个关键酶基因AaPMT和AaTRI共转化三分三，将打破托品烷生物碱生物合成途径的瓶颈效应，获得高产托品烷生物碱的三分三毛状根或植株，为商业化大量生产托品烷生物碱提供了可能，更为药品价格的降低提供了可能。迄今为止，国内外从三分三中分离克隆双关键酶基因并且通过共转化策略来提高三分三毛状根中托品烷生物碱含量的研究尚鲜见报道。因此，本发明在实际解决托品烷生物碱药源紧缺性的问题上具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服常规技术获得托品烷生物碱中的不足，提供一种有效提高三分三毛状根中托品烷生物碱含量的方法。本发明还提供了实现上述方法的重组载体。一种用于提高脱品烷生物碱含量的重组载体，含有腐胺N-甲基转移酶基因和托品酮还原酶I基因。本发明应用双关键酶基因共转化策略提高三分三毛状根托品烷生物碱含量的方法，采用基因工程方法，将双关键酶基因(AaPMT，AaTRI)导入三分三外植体中，通过发根农杆菌的侵染获得了高产托品烷生物碱的三分三毛状根株系。本发明是通过以下技术方案实现的从三分三中克隆AaPMT和AaTRI基因，构建含这两个基因的cDNA分子的植物双元表达载体，以发根农杆菌为介导，将AaPMT和AaTRI基因同时导入三分三外植体中并获得毛状根；PCR检测目的基因AaPMT和AaTRI在三分三基因组中的整合情况，半定量和定量RT-PCR分析目的基因AaPMT和AaTRI在毛状根中的表达情况，高效液相色谱测定三分三转基因毛状根中托品烷生物碱的含量，DPPH法测定转基因毛状根中托品烷生物碱的抗氧化活性。双基因共转化提高托品烷生物碱含量的方法，包括如下具体步骤(1)将腐胺N-甲基转移酶基因AaPMT和托品酮还原酶I基因AaTRI，插入植物表达载体，构建重组载体；所述的腐胺N-甲基转移酶基因和托品酮还原酶I基因序列分别为 SEQ ID :1 禾口 SEQ ID :2 的 DNA 序列；(2)将步骤(1)所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；(3)用步骤(2)所得含有重组载体的发根农杆菌介导腐胺N-甲基转移酶基因和托品酮还原酶I基因转化三分三，获取毛状根；(4)检测步骤(3)毛状根中的腐胺N-甲基转移酶基因和托品酮还原酶I基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根。托品烷生物碱生物合成关键酶基因AaPMT和AaTRI利用基因克隆方法从三分三中获得。步骤(1)所述的植物表达载体为pCAMBIA质粒或pBI质粒。步骤( 所述发根农杆菌为发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株A4或发根农杆菌菌株L BA9402。步骤C3)用含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化三分三的外植体，获得毛状根。步骤(4)所述检测方法为PCR检测和半定量RT-PCR测定。所述的PCR检测中，在植物表达载体上启动插入基因(AaPMT，AaTRI)表达的组成型表达启动子CaMV35S的内部及插入基因的内部(通常在开放阅读框的终止密码子处)设计上游及下游特异性引物进行DNA的PCR扩增，紫外线下观察到目的条带的株系即为阳性转基因毛状根株系。所述的半定量RT-PCR测定三分三转基因毛状根中托品烷生物碱生物合成相关基因(AaPMT，AaTRI)的表达的方法为对经PCR鉴定为阳性的毛状根株系进行总RNA的提取， 并定到同一量的总RNA反转成cDNA第一条链体系作为模板，分别设计插入目的基因及看家基因ISSrRNA的引物，取相同量的上述cDNA第一链体系为模板进行半定量RT-PCR扩增，分析相关基因(AaPMT，AaTRI)的相对表达量。根据三分三腐胺_N_甲基转移酶基因(AaPMT)， 托品酮还原酶I (AaTRI)和和18S rRNA序列设计定量PCR引物，进行定量PCR操作和定量 PCR的结果分析。本发明应用常规生物学实验方法如载体构建、遗传转化、分子检测、半定量和定量 RT-PCR分析、托品烷生物碱提取及含量测定、抗氧化活性研究等，建立了一种提高三分三毛状根中托品烷生物碱含量的方法，为商业化大量生产托品烷生物碱和降低药品价格提供了可能，在缓解托品烷生物碱药源的紧缺性问题上具有十分重要的意义。
图1为实施例2转基因毛状根的载体构建。图2为实施例3转基因毛状根的PCR鉴定结果。图3为实施例4转基因毛状根中目的基因的表达谱半定量检测结果，AaPMT T and AaTRI T代表转基因毛状根中总的AaPMT和AaTRI基因；AaPMT E andAaTRI E代表三分三中内源的AaPMT和AaTRI基因；BC代表非转基因对照，PT为同时转入AaPMT和AaTRI基因毛状根，T为单转入AaPMT基因毛状根，P为单转入AaPMT基因毛状根。图4为实施例4转基因毛状根中目的基因的表达谱定量检测结果。图5为HPLC法测转基因毛状根P line的托品烷生物碱含量。图6为HPLC法测转基因毛状根T line的托品烷生物碱含量。图7和图8为HPLC法测转基因毛状根PT line的托品烷生物碱含量。图9为PT line的总托品烷生物碱含量，BC为空对照(pCAMBIA1304+质粒遗传转化三分三获得的毛状根)。图10为山莨菪碱、莨菪碱、樟柳碱和东莨菪碱标准品和样品HPLC图谱。A 为.标准品谱图，B 为 P3 line, C 为 T12 line, D 为 PT18 line, E 为 BC line, 1-山莨菪碱，2-莨菪碱，3-樟柳碱，4-东莨菪碱。图11为DPPH自由基清除活性随转基因毛状根中不同克隆(PT18，T12和P3)托品烷生物碱浓度变化趋势图。
具体实施例方式下面结合具体实施例详细阐述本发明。应理解为这些实施例仅用于说明本发明
5而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆(Sambrook等)，或按照制造厂商所提供的试剂或试剂盒所附带的说明书建议的条件。实施例11. 1.三分三毛状根总RNA的提取及cDNA第一链的合成使用TIANGEN公司提供的RNA prep pure plant kit从三分三转基因毛状根中提取总RNA(提取步骤参照试剂盒内的说明书)。用于提取总RNA的三分三转基因毛状根的鲜重量为0. lg-0. 15g左右，在提取过程中样品中的DNA已用DNase工作液清除。将提取的 RNA在分光光度计上测定相关的吸光值，计算所提取RNA的纯度及浓度。最终各个样品都以 1 μ g RNA为起始量，用反转录酶XL (AMV)进行第一链cDNA的合成(操作步骤参照Promega 公司提供的相关说明书)。1. 2. AaPMT和AaTRI编码序列特异引物的设计及目的基因片段的获得根据所述AaPMT基因(PMT ；EC. 2.5.1. 53)的编码序列和AaTRI基因(TRI ；EC 1. 1. 1. 206)的编码序列，分别设计扩增出完整编码框的上下游特异引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建植物表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。测序结果表明，所克隆的序列与我们实验室在GenBank上登录的三分三AaPMT 基因和AaTRI基因的编码序列完全一致。引物序列如下AaPMTI Forward 5' -ATGGAGGTCATAAGCAACCAC-3‘AaPMTI Reverse :5， -TCAAAATTCAACCAAATCCC-3，AaTRI Forward 5' -ATGGGAGAATCAAAAGTTTACAT-3‘AaTRI Reverse :5’ -TCAAAATCCACCATTAGCTGTGA-3’实施例2含三分三AaPMT and/or AaTRI基因的植物表达载体的构建2. 1.中间载体pCAMBIA1304+的构建(见图1)以pBI121和pCAMBIA1304为材料，构建植物表达载体pCAMBIA1304+。具体为 Hindlll/EcoRI 双酶切 pBI121 和 pCAMBIA1304 ；回收 pBI121_GUS 表达盒及 pCAMBIA1304 大片段；连接转化，挑取单克隆菌落抽提质粒酶切验证。结果表明，植物表达载体 PCAMBIA1304+构建成功。如图1所示。2. 2.植物表达载体 pCAMBIA1304+_AaPMT 的构建在上述构建成功的PCAMBIA1304+基础上，用从三分三中克隆到的AaPMT基因替换其上的 GFP+GUS 基因。具体地，Bglll/BstEII 双酶切 pMD18T_AaPMT 和 pCAMBIA1304+ ；回收 AaPMT基因及pCAMBIA1304+大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，AaPMT基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304+中， 从而获得含AaPMT基因的植物表达载体pCAMBIA1304+-AaPMT。pCAMBIA1304+-AaTRI植物表达载体的构建过程和pCAMBIA1304+_AaPMT植物表达载体的构建过程和步骤是一样的，用AaTRI基因替换pCAMBIA1304+上的GFP+GUS基因。2.3.植物表达载体 pCAMBIA1304+-AaPMT-AaTRI 的构建以上述的pCAMBIA1304+_AaTRI为基础，用从三分三中克隆的AaPMT基因替换 pCAMBIA1304+-AaTRI 上的 GUS 基因。具体地，用 BamHI/SacI 双酶切 pMD18T_AaPMT 和pCAMBIA1304+-AaTRI ；回收AaPMT基因及pCAMBIA1304+_AaTRI大片段；连接转化,挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，AaPMT基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304+-AaTRI中，从而获得含AaPMT和AaTRI基因的植物表达载体 pCAMBIA1304+-AaPMT-AaTRI。本 实施例将托品烷生物碱生物合成途径中的关键酶基因AaPMT和AaTRI 可操作性地连于表达调控序列，形成含AaPMT和AaTRI基因的植物表达载体 pCAMBIA1304+-AaPMT-AaTRI，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高三分三中托品烷生物碱的含量。实施例3发根农杆菌介导AaPMT和AaTRI基因遗传转化三分三获得转基因毛状根3. 1.含植物表达载体PCAMBIA1304+-AaPMT-AaTRI发根农杆菌工程菌的获得将实施例2中含AaPMT和AaTRI基因的植物双价表达载体体 PCAMBIA1304+-AaPMT-AaTRI转入发根农杆菌C58C1中，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含AaPMT和AaTRI基因的植物表达载体已成功构建到发根农杆菌菌株C58C1中。3. 2.发根农杆菌介导AaPMT，AaTRI基因遗传转化三分三3. 2. 1.外植体的预培养剪取培养在MS固体培养基(培养基在透明塑料培养罐中)上的三分三无菌苗叶片(IcmXlcm)和茎段(Icm)外植体，接种到预培养培养基MS (培养基在培养皿中)上，25°C 暗培养2d。3. 2. 2.农杆菌与外植体的共培养侵染前，取出预培养的三分三叶片和茎段外植体，放入活化好的C58C1的V2MS悬液中浸泡8min，轻轻摇动使外植体与菌液充分接触。倒出悬液，用无菌吸水纸吸干表面余菌，转到共培养培养基MS (培养基在培养皿中)中，暗培养2d。以浸泡在不带有发根农杆菌 C58C1的1/2MS液体培养基中的叶片和茎段外植体为对照。3. 2. 3.毛状根的诱导和继代培养将共培养2d的三分三外植体转入到脱菌培养基B5+Cef 500mg/L中，25°C 16h/8h 暗培养。14 21d左右即可从外植体边缘切口处长出毛状根。剪取毛状根(大约2-3cm)， 接种于脱菌培养基B5+Cef300mg/L中暗培养两周，选择生长快、分枝好的毛状根转入脱菌培养基B5+Cef 100mg/L中继代筛选，每两周继代培养一次，抗生素的浓度逐渐降低，经过 5-6次继代后即可完全脱菌。再将生长良好的三分三毛状根转入无抗生素的B5固体培养基上继续暗培养20d左右，用该完全脱菌的毛状根来进行分子鉴定、液体培养、含量测定及基因表达分析等。3. 3.转基因三分三毛状根的PCR及检测3. 3. 1.转基因三分三毛状根基因组DNA的提取本发明用TIANGEN生化科技有限公司提供的DNA提取试剂盒来提取转基因毛状根基因组DNA。剪取3. 2. 3中除菌完毕的转基因毛状根5cm左右放入培养皿中，加入适量液氮，用研磨棒将材料充分磨碎。然后按照说明书里面提供的方法提取基因组DNA。提取成功后放入_80°C超低温冰箱冻存，备用。3.3.2.引物设计及PCR检测在pCAMBIA1304+-AaPMT_AaTRI上启动插入目的基因(AaPMT和AaTRI)表达的组成型表达启动子CaMV35S及插入基因(AaPMT和AaTRI)上分别设计特异性上游及下游引物， 用PCR方法对上述毛状根的总DNA进行分子检测。结果表明，利用上述特异引物，在一部分转基因毛状根中能检测到和阳性对照(pCAMBIA1304+-AaPMT -AaTRI质粒为模板)大小相当的PCR产物。而以pCAMBIA1304+空载体遗传转化三分三所发出的毛状根基因组DNA为模板时，则检测不到插入基因(AaPMT和AaTRI)的存在(见图2)。引物设计如下35 S PROM 252F :5’ -ATGGAGGTCATAAGCAACCAC-3，AaPMT KR :5，-TCAAAATTCAACCAAATCCC-3，35S PROM 252F :5’ -ATGGAGGTCATAAGCAACCAC-3，AaTRI KR :5，-TCAAAATCCACCATTAGCTGTGA-3，图2为转基因毛状根的PCR鉴定。双转基因克隆(PT lines)的AaPMT (1269bp)和 AaTRI genes (1074bp)的 PCR 鉴定(Al 和 A2)；单转 AaPMT 基因克隆(P lines)的 PCR 鉴定 (B)；单转AaTRI基因克隆(T lines)的PCR鉴定(C) ；M. :DL2000分子大小标记；PC为阳性对照(包含目的基因的质粒)；BC为阴性对照(通过不带目的基因的发根农杆菌C58C1形成的毛状根)。结果说明AaPMT和AaTRI基因已经整合到三分三基因组中。实施例4半定量和定量RT-PCR检测转基因三分三毛状根中AaPMT和AaTRI基因的表达4. 1.毛状根液体培养选择实施例3中生长快、分枝好的毛状根，在超净工作台上剪取2-3cm用无菌蒸馏水冲洗掉其表面上的琼脂后接入装有150ml 1/2MS液体培养基的培养瓶中100rpm，27°C黑暗下培养，每20天更换新鲜1/2MS液体培养基继代一次，60天后收获，取适量新鲜毛状根用吸水纸吸干表面水分后，用锡箔纸包好浸入液氮中冷冻后保存于-80°C用于RNA提取，其余毛状根烘干后用于托品烷生物碱含量提取。4. 2.引物的设计和合成根据托品烷生物碱生物合成代谢途径关键酶基因AaPMT和AaTRI的编码序列分别设计引物用于检测三分三毛状根中总的AaPMT和AaTRI基因的表达情况(AaPMT，AaTRI皆为三分三来源基因)，而通过在AaPMT和AaTRI的3’编码序列分别设计一个下游引物和目的基因上的上游引物配对则可以检测内源基因的表达情况(转入的外源基因仅是基因的编码框序列，不带有5’及3’非编码序列)，看家基因18S rRNA用来作为内参。所用引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下半定量PCR引物AaPMT Forward 5' -ATGGAGGTCATAAGCAACCAC-3‘AaPMT Reverse :5， -TCAAAATTCAACCAAATCCC-3，AaTRI Forward 5' -ATGGGAGAATCAAAAGTTTACAT-3‘AaTRI Reverse :5， -TCAAAATCCACCATTAGCTGTGA-3，18SrRNA Forward 5' -GTGACAATGGAACTGGAATGG-3，18SrRNA Reverse :5， -AGACGGAGGATAGCGTGAGG-3，定量PCR 引物AaPMT26F 5' -TGGCAGCACCACCAAAATTA-3‘AaPMT163R 5' -TGGCCAGAGTGCGCTAAACT-3‘AaTRI515F 5' -TGCTTCCAAAGCTGCAATAA-3‘
AaTRI595R 5' -TAAAATGATTCCCGGAGCAA-3‘4. 3. RNA的提取及cDNA第一链的合成方法同1. 14. 4.半定量RT-PCR检测AaPMT，AaTRI及看家基因18S rRNA基因的表达以相同量的上述cDNA第一链为模板，分别用上述设计的引物进行PCR扩增。PCR
反应体系如下
权利要求
1.AaPMT和AaTRI双基因共转化提高托品烷生物碱含量的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将腐胺N-甲基转移酶基因AaPMT和托品酮还原酶I基因AaTRI，插入植物表达载体，构建重组载体；所述的腐胺N-甲基转移酶基因和托品酮还原酶I基因序列分别为SEQ ID :1 禾口 SEQ ID 2 的 DNA 序列；(2)将步骤(1)所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌;(3)用步骤( 所得含有重组载体的发根农杆菌介导腐胺N-甲基转移酶基因和托品酮还原酶I基因转化三分三，获取毛状根；(4)检测步骤(3)毛状根中的腐胺N-甲基转移酶基因和托品酮还原酶I基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根。
2.权利要求1所述AaPMT和AaTRI双基因共转化提高脱品烷生物碱的含量的方法，其特征在于，所述其特征在于，步骤(1)所述的植物表达载体为pCAMBIA质粒或pBI质粒。
3.权利要求1所述AaPMT和AaTRI双基因共转化提高脱品烷生物碱含量的方法，其特征在于，所述其特征在于，步骤( 所述发根农杆菌为发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株A4或发根农杆菌菌株LBA9402。
4.权利要求1所述AaPMT和AaTRI双基因共转化提高脱品烷生物碱的含量的方法，其特征在于，步骤C3)用含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化三分三的外植体，获得毛状根。
5.权利要求1所述AaPMT和AaTRI双基因共转化提高脱品烷生物碱含量的方法，其特征在于，步骤(4)所述检测方法为PCR检测、半定量和定量RT-PCR测定。
6.一种用于提高脱品烷生物碱含量的重组载体，其特征在于，含有腐胺N-甲基转移酶基因和托品酮还原酶I基因。
全文摘要
本发明是一种生物工程技术领域的提高三分三毛状根中托品烷生物碱含量的方法。本发明利用从药用植物三分三根部克隆得到的限速酶基因AaPMT和AaTRI基因的编码框序列构建含AaPMT和AaTRI基因的植物双价高效表达载体，通过发根农杆菌为介导，对三分三外植体进行双基因转化，从而获得转AaPMT和AaTRI基因的三分三毛状根，其中托品烷生物碱的平均含量明显提高。本发明提供了一种提高三分三毛状根托品烷生物碱含量的方法，从而为临床所需求的托品烷生物碱提供了更多的来源和巨大的商业需求。
文档编号A01H5/06GK102212548SQ20111008346
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者刘源云, 周文涛, 开国银, 杨胜, 罗秀芹 申请人:上海师范大学