专利名称：家蚕糖受体蛋白基因Bmor2及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及家蚕食性相关的糖受体蛋白基因。
背景技术：
味觉系统能检测和区分不同的味觉刺激，这是所有动物所具有的普遍特征。植食性是 鳞翅目昆虫的一个重要特性。家蚕是一种寡食性经济昆虫，幼虫仅食桑叶。家蚕取食主要
包含两个阶段第一，家蚕幼虫接受外界气味物质所刺激，发生趋向反应。气味物质透过 幼虫触角嗅孔，进入到触角淋巴液腔，与高浓度的气味结合蛋白结合形成复合体，然后通 过淋巴液循环，运输到嗅觉神经细胞膜上，与特异嗅觉受体结合，刺激电信号的产生，生 物电信号经过细胞信号传导途径，到达大脑中枢，进而调节家蚕的行为反应。第二，当家 蚕被某种喜好气味所吸引，并到达该物质处，将发生咬食、吞咽行为，该物质中所含成分 将刺激家蚕唇瓣、咽下经节等处的神经细胞，其上的味觉受体与其作用后，产生特异电 信号，经过传导、神经反馈等调节，促使家蚕对食物作出选择。
家蚕基因组编码了能识别植物成分中多种化合物的基因，其中同属于GPCR家族成员
的嗅觉和味觉受体基因在家蚕觅食、摄食过程中起到了至关重要的作用。味觉受体多分布 在唇瓣、下颚、触角等部位的化学感受器神经细胞中，轴突延伸到大脑中的咽下神经节。 味觉神经细胞感知食物中的糖、水和盐等成分，并产生相应的生理电信号，进而调节家蚕 的择食行为。桑叶作为家蚕的主要食物，所含成分复杂，主要包括糖类、甾体及三萜类化 合物、多种氨基酸、生物碱、有机酸及其它化合物，其中糖类与蛋白质或氨基酸成分比列， 对家蚕的生长发育、蚕丝蛋白的合成、蚕茧质量等有密切的关系。甜味物质的感知是生物 的重要味觉特征之一，诸如果蝇、家蚕等以摄取糖类物质作为主要营养物质的生物尤为明 显。他们利用特有味觉受体从植物中有害的苦味化学物中区分富含糖、氨基酸的营养物质。 因此，对糖类物质的敏感性，直接关系到家蚕的择食行为。
随着家蚕基因组数据的日益完善，我们从中获得了大量的信息，筛选出了与感知糖类 物质直接相关的味觉受体基因。
发明内容
本发明将家蚕寡食性机制研究与现代基因工程育种相结合，其目的在于提供一种与家 蚕寡食性直接相关的糖受体基因，对糖受体基因的研究，将在家蚕育种等方面有广阔的应用价值。
基于味觉受体的结构和特异表达模式，我们得到了一个感知糖的受体基因，具体方法 如下
(1) 在http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/下载果蝇等昆虫所报道的糖受体基因序列；
(2) 将序列在家蚕基因组海量数据中进行tBLASTn比对，为了得到可能的同源序列， E值为默认的10;
(3) 序列同源性分析味觉受体序列分化严重，同源性较低，故将E值小于5的各 序列从家蚕基因组数据中提出来，并在http://www.softberry.com/berry.phtml对其相应片段 约1万个BP范围内DNA序列进行基因预测；
(4) 将所预测得到的基因完整的ORF，在NCBI中进行BLAST,验证所得结果是否 为目的基因，结果表明，家蚕糖受体一个具有7次跨膜结构域的G-蛋白偶联受体，为一个 新基因；
(5) ^ww2cDNA克隆的获得根据预测所得到的^wod完整的ORF设计引物，以 家蚕幼虫头RNA反转录得到的cDNA为模板扩增，扩增片段克隆到Pmdl8-T(上海Sangon) 载体上，然后进行序列测定与拼接，从而获得^^r2cDNA基因克隆；
(6) 细胞水平验证Smw2:利用RNAi、 EAG等技术，验证了 Smod对糖类物质敏 感，为家蚕糖受体蛋白基因。
上述方法获得的基因完整的ORF及其推断的氨基酸序列如下:
ATGCTTTCTTTGCTTTCGAAATTCGTAATAACGATGGACTGT TTACCAAAGGGCAGTGAT
MLSSKFVITMDC LPKGSD
CTTTTTGAAAGTTACATCATCAGGMCTTTCCTTGGTTGTTC GAATTTGACTTCCTGACT
FESYIIRNFPWLF EFDFT
TTGGTATCAACGATTAATTGGAGCTACTCAGATCTGTTCATA GTGTGCATGAGCATTTAC
VSTINWSYSDLFI VCMSIY
CTTACATCCATATTAAMCAGATCMCMGMAATAGAGATG GCTGGTAATTCCGTGAGT
LTSILKQINKKIEM AGNSVS
ATCTTTTATAGCGTAAGCAAGGTCATGMAATTCMATTGAG AACTATGACTTAGAATCA
IFYSVSKVMKIQIE NYDES
CCTGCCTATACCGTTCTGGCGMCATTACGGGAAGACTACAC AAGAGCAACGCGTCTCGT
PAYTVLANITGRLH KSNASR
TCGCAGCTTCGACGATACAATCAGCAGCGTTATATTTTTATC GTTTGCCTCMATCTATT
SQRRYNQQRYIFI VCKSI
TTTTATATGTCTACAATTGTACAATATACTATCGTGAGTATA ACTGATTTCATTGAAACA
FYMSTIVQYTIVSI TDFIET
AACTTTTTTTTATTGCTTAGATGGGTGGACGAGCTCACAGTG GCACAGCTTTCGCCATTA
NFFLRWVDETV AQSPGGC GGT TAC GAA CM ATA ATG TAT TTA TTG TTC TCT CTT TCG TTC CTA TTG GGT CGT TCT
GGYEQIMYLLFSLSFLLGRS CTA GTC GTC TCG CTT GTC GCA GCC AAA GTA CAC TCT GCT TCG ATG GTA CCG GCT TCA GCT
LVVSLVAAKVHSASMVPASA TTG TAT AAC ATA CCA CGA AAT ATG TAC TGT TCG GM ATT CAG AGG TTC TTG GAC CAA GTG
LYNIPRNMYCSEIQRFLDQV CAT GGT GAT AAG GTC GCG TTG AGC GGT CTT CGT TTT TTT TAC GTC ACT AGA AGC CTG GTT
HGDKVALSGLRFFYVTRSLV TTG TCG GTT GCT GGC ACT ATT GTC ACT TAC GAG CTG GTG TTG CTT CAA TTC AGC AAT GAA
LSVAGTIVTYELVLLQFSNE GAT TAA
D 氺
基因在培育广食性家蚕品种中的应用。 本发明的优点是-
(1) 首次从家蚕全基因组数据中筛选得到对糖类物质敏感的味觉受体基因完 整地0RF，获得克隆，并深入研究，证实其功能，为今后研究家蚕味觉发生机制提供了基 础。
(2) 利用基因育种方法，可育成广食性的家蚕品种，打破家蚕寡食性常规，减小桑 树繁殖的季节性影响，更大可能的获取经济价值。
(3) 通过对家蚕食性所涉及到的功能基因的研究，为研制新型的家蚕人工饲料提供 理论依据。
具体实施例方式
实施例
在11 ://^^11(^.11101.11化^(^/下载果蝇等昆虫所报道的糖受体基因序列，与家蚕基因 组海量数据中进行tBLASTn比对，将E值小于5的各序列从家蚕基因组数据中提出来， 并在http:〃www.softberry.com/beny.phtml对其相应片段约I万个BP范围内DNA序列进行 基因预测；然后在NCBI中进行BLAST验证，结果表明，家蚕糖受体一个具有7次跨膜 结构域的G-蛋白偶联受体，为一个新基因；根据预测所得到的Sww2完整的ORF设计引 物(正向引物5， GAAAGCAAGATTCACMA 3';反向引物5， CTATAGTACTGATATTGT 3');以家蚕幼虫 头RNA反转录得到的cDNA为模板扩增，扩增片段克隆到pMD18-T (Sangon)载体上， 然后进行序列测定(西南大学蚕学与系统生物学研究所)，从而获得Bww2cDNA基因克隆； 利用RNAi、 EAG等技术，验证了5/nw2对糖类物质敏感，为家蚕糖受体蛋白基因。序列表
SEQUENCE LISTING <110>西南大学
<120〉家蚕糖受体蛋白基因Bmor2 <130>
<140> 〈141〉
<160〉 1
<170>
〈210〉 1
〈211> 846
〈212〉 DNA
〈213〉 家蚕(Bombyx mori)
〈400> 1
1ATGCTTTCTTTGCTTTCGMATTCGTAATAACGATGGACTGTTTACCAAAGGGCAGTGAT
61CTTTTTGAAAGTTACATCATCAGGAACTTTCCTTGGTTGTTCGAATTTGACTTCCTGACT
121TTGGTATCMCGATTAATTGGAGCTACTCAGATCTGTTCATAGTGTGCATGAGCATTTAC
181CTTACATCCATATTAAAACAGATCAACMG嵐ATAGAGATGGCTGGTMTTCCGTGAGT
241ATCTTT窗AGCGTMGCMGGTCATGAMATTCMATTGAGMCTATGACTTAGAATCA
301CCTGCCTATACCGTTCTGGCGMCATTACGGGMGACTACACAAGAGCAACGCGTCTCGT
361TCGCAGCTTCGACGATACMTCAGCAGCGTTATATTTTTATCGTTTGCCTCAAATCTATT
421TTTTATATGTCTACMTTGTACMTATACTATCGTGAGTATMCTGATTTCATTGAAACA
481AACTTTTTTTTATTGCTTAGATGGGTGGACGAGCTCACAGTGGCACAGCTTTCGCCATTA
541GGCGGTTACGMCMATAATGTATTTATTGTTCTCTCTTTCGTTCCTATTGGGTCGTTCT
601CTAGTCGTCTCGCTTGTCGCAGCCAMGTACACTCTGCTTCGATGGTACCGGCTTCAGCT
661TTGTATMCATACCACGAAATATGTACTGTTCGG嵐TTCAGAGGTTCTTGGACCMGTG
721CATGGTGATAAGGTCGCGTTGAGCGGTCTTCGTTTTTTTTACGTCACTAGMGCCTGGTT
781TTGTCGGTTGCTGGCACTATTGTCACTTACGAGCTGGTGTTGCTTCMTTCAGCMTGAA
841GATTM
<210> 2 <211> 281 <212> PRT
〈213〉家蚕(Bombyx mori) <400> 1
1 MLSLLSKFVI TMDCLPKGSD LFESYIIRNF PWLFEFDFLT LVSTINWSYS DLFIVCMSIY
661 LTSILKQINK KIEMAGNSVS IFYSVSKVMK IQIENYDLES PAYTVLANIT GRLHKSNASR
121 SQLRRYNQQR YIFIVCLKSI FYMSTIVQYT IVSITDFIET NFFLLLRWVD ELTVAQLSPL 181 GGYEQIMYLL FSLSFLLGRS LVVSLVAAKV HSASMVPASA LYNIPRNMYC SEIQRFLDQV 241 HGDKVALSGL RFFYVTRSLV LSVAGTIVTY ELVLLQFSNE D
权利要求
1、一种家蚕糖受体蛋白基因Bmor2，其特征在于其序列如下1 ATGCTTTCTT TGCTTTCGAA ATTCGTAATA ACGATGGACT GTTTACCAAA GGGCAGTGAT61 CTTTTTGAAA GTTACATCAT CAGGAACTTT CCTTGGTTGT TCGAATTTGA CTTCCTGACT121 TTGGTATCAA CGATTAATTG GAGCTACTCA GATCTGTTCA TAGTGTGCAT GAGCATTTAC181 CTTACATCCA TATTAAAACA GATCAACAAG AAAATAGAGA TGGCTGGTAA TTCCGTGAGT241 ATCTTTTATA GCGTAAGCAA GGTCATGAAA ATTCAAATTG AGAACTATGA CTTAGAATCA301 CCTGCCTATA CCGTTCTGGC GAACATTACG GGAAGACTAC ACAAGAGCAA CGCGTCTCGT361 TCGCAGCTTC GACGATACAA TCAGCAGCGT TATATTTTTA TCGTTTGCCT CAAATCTATT421 TTTTATATGT CTACAATTGT ACAATATACT ATCGTGAGTA TAACTGATTT CATTGAAACA481 AACTTTTTTT TATTGCTTAG ATGGGTGGAC GAGCTCACAG TGGCACAGCT TTCGCCATTA541 GGCGGTTACG AACAAATAAT GTATTTATTG TTCTCTCTTT CGTTCCTATT GGGTCGTTCT601 CTAGTCGTCT CGCTTGTCGC AGCCAAAGTA CACTCTGCTT CGATGGTACC GGCTTCAGCT661 TTGTATAACA TACCACGAAA TATGTACTGT TCGGAAATTC AGAGGTTCTT GGACCAAGTG721 CATGGTGATA AGGTCGCGTT GAGCGGTCTT CGTTTTTTTT ACGTCACTAG AAGCCTGGTT781 TTGTCGGTTG CTGGCACTAT TGTCACTTAC GAGCTGGTGT TGCTTCAATT CAGCAATGAA841 GATTAA。
2、 一种家蚕糖受体蛋白基因^WW2编码的蛋白质，其特征在于其序列如下<formula>formula see original document page 2</formula>
3、 S歸d基因在培育广食性家蚕品种中的应用。
全文摘要
一种家蚕糖受体蛋白基因Bmor2，利用已报道的昆虫(如果蝇)，糖受体蛋白基因序列，在家蚕基因组海量数据中进行tBLASTn，预测得到的同源片段中基因完整ORF，通过NCBI上BLAST验证，最终鉴定得到了糖受体蛋白基因Bmor2。利用基因育种方法，可育成广食性的家蚕品种，打破家蚕寡食性常规，减小桑树繁殖的季节性影响，更大可能的获取经济价值；通过对家蚕食性所涉及到的功能基因的研究，为研制新型的家蚕人工饲料提供理论依据。
文档编号C12N15/12GK101492679SQ200810233308
公开日2009年7月29日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者向仲怀, 夏庆友, 徐汉福, 英 林, 萍 赵 申请人:西南大学