农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法

专利名称：农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法
技术领域：
本发明涉及一种植物基因转化的方法，特别是一种利用农杆菌介导的植物基因转化方法。
随着人口增长、环境污染、土地贫瘠造成的可耕地面积不断缩小及原材料的逐渐减少，人类对作物品质改良的要求也越来越紧迫。过去传统的杂交育种方式，主要从降低株高、缩短生长发育时间和利用杂种优势大幅度地提高产量。但是在现阶段，改良作物品质已经不能单纯依靠杂交育种的手段，以分子生物学为基础的生物技术近几年来进展迅速，成为农业、食品、化学材料、医药、环境等研究领域的主要发展动力。
自1983年第一例转基因植物问世以来，虽然只有18年的时间，但植物基因工程的发展却日新月异，硕果累累。植物基因工程使作物育种从杂交育种走向基因育种，极大地拓宽了作物育种的深度和广度，人们已经能够跨越物种间的界限，定向地改造作物性状，从而使作物育种的进度大大加快。迄今为止，利用植物转基因技术已在培育抗病、抗虫作物品种、改良作物品质、提高作物产量和抗逆性等方面取得了显著进展，已有一批转基因植物投入生产。
在农作物基因转化研究中，植物基因转化方法对遗传转化是至关重要的，它决定了如何高效地将外源基因导入植物细胞，并再生出转基因植株。迄今已建立的基因转化方法，以转化原理区分，可基本上分为三类以土壤根癌农杆菌、病毒等为载体的转化方法如农杆菌转化法；不用任何载体，采用物理、化学方法直接将外源基因导入受体细胞的直接转化法；以植物自身的生殖系统、种质细胞，如花粉粒或其它细胞等为媒体的转化方法。这三类植物基因转化方法在使用的载体、转化原理及受体细胞的选择上均有明显差异。
PEG介导法、电击法、微针注射法都是以原生质体做为受体材料的植物基因转化方法，它们的最大优点是无宿主范围，适用于各种作物，特别是能应用于单子叶植物。其另一个重要特点是通过原生质体转化获得的再生植物无嵌合体发生，有利于生产实践的应用，而且能够一次处理很多原生质体，是瞬间表达研究的较好系统。但是目前对于大多数的植物而言，原生质体分离培养以及再生仍然比较困难，再生频率低、重复性差，不易获得转化植株，特别是单子叶植物原生质体的分离培养更困难，因此，这种转化方法比以组织或器官为受体的转化方法要复杂的多，困难的多。
基因枪法是近年来迅速发展起来的转化方法，它克服了以原生质体为受体细胞的缺点，可适用于任何植物和材料。但是应该看到，这种转化方法所要求的仪器设备复杂昂贵，耗资大，外源基因多以多拷贝插入被转化组织细胞的基因组中，不易得到稳定转化，而且该方法也是以组织培养为基础，实验周期较长。该项技术目前还不十分成熟，外源DNA整合的机理尚不清楚，整合的外源DNA有拷贝数较多，遗传性较差等问题，尚需进一步的完善和深入研究。而且这种方法的关键取决于受体外植体的选择，所选择的轰击受体，一定要具有强的器官分化潜能。
许宁等进行了超声波诱导动植物细胞外源基因导入的实验，并且在WO专利91/00358研究的基础上，给出了一种超声波诱导植物组织基因转移的方法CN1180746A。该方法是将植物组织块经预处理后放入盛有适合于植物组织培养且含有外源DNA的缓冲液的容器中，再将超声波探头置于容器壁上或直接伸入溶液中，开启超声波，在脉冲型超声波的作用下，将外源基因导入植物组织块中。这种基因导入的方法既适合于双子叶植物，也适合于单子叶植物，特别是禾谷类作物的基因转化，具有设备便宜，转化效率高的优点。但是，该方法仍需要用组织培养的方法诱导产生愈伤组织，依然摆脱不了进行植物组织的离体培养这一复杂的操作过程。
可以看出，直接基因转化法都需要经过对植物的组织、细胞或原生质体等进行离体培养和再生过程才能获得转基因植株。由于离体培养过程复杂，容易发生变异以及再生能力差等原因，导致利用直接基因转化法获得转基因植株的转化率较低，而且由转化至获得转基因植株的周期也相对较长。
近年来，科学家们又提出了种质转化的概念，借助植物有性生殖过程，以生殖细胞(如花粉粒、子房等)为受体细胞，进行基因转化，如花粉管导入法、子房注射法等。利用种质系统进行基因转化既可以避开经验性很强的组织培养，又可以克服植株再生的困难，其受体细胞可以直接是具有全能性的单倍体的生殖细胞或受精卵细胞，使得现代生物工程技术与常规育种紧密结合，容易得到大量的种子以供筛选。其转化方法简便易行，是一种颇有潜力的基因转化方法。但是，该转化方法的基因转化机制至今仍有异议，而且基因的转化受到诸如花期等因素的限制，基因转化时间有一定局限性。我们也应该看到，种质系统基因转化方法的实质只是利用种质细胞作为一种基因导入的中间体，其外源基因的导入仍需要使用诸如农杆菌共培养、电激法、微针注射法、基因枪法等转化方法进行，实验操作仍然复杂。
在众多的植物基因转化方法中，农杆菌介导转化方法是目前研究最多、理论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化方法。与其它基因转化方法相比，农杆菌介导转化方法具有转化率高、转化植株遗传稳定性好，可以容纳相当大的DNA片段插入等多项优点，是双子叶植物最理想的转化方法。目前获得的转化成功事例中，80％采用的是此方法。但是，此方法存在着宿主范围小、菌株特异性强等问题，其最大的缺点是仅适用于大多数的双子叶植物，对于单子叶植物，特别是禾本科植物不敏感，从而限制了它的适用范围。然而，由于主要的禾谷类粮食作物都属于单子叶植物，因此，单子叶植物的基因转化研究更具有重大的生产意义。
近几年来的研究工作越来越使人们相信，随着农杆菌侵染机理的深入研究和揭示，采用相应的技术措施是能够使农杆菌Ti质粒成为单子叶植物的一种理想转化载体。研究发现，当使用乙酰丁香酮等对VirG基因具有诱导活性作用的诱导物处理时，可以提高农杆菌对单子叶植物的转化率。然而，解决单子叶植物感染不敏感的根本途径还是应该构建广宿主范围、超毒能力的质粒载体。
总之，在目前已经建立的基因转化方法中，最为完善和有效的是农杆菌介导基因转化方法。继Marton等首次建立农杆菌Ti质粒上T-DNA向烟草原生质体中转移的离体转化系统以来，研究者们将这一共培养转化系统又广泛地应用于愈伤组织悬浮培养细胞、叶圆盘、茎切段、子叶切片以及下胚轴切段等离体材料的转化，并寻求着更为简便有效的受体系统和转化方法。然而，上述各种受体系统均需经过严格的组织离体培养与再生过程才能够获得转基因植株，且培养的结果常常不尽如人意。因此，探寻避开组织培养的有效基因转化方法在这方面就显得更具有实际意义。
本发明的目的是提供一种新的植物基因转化方法，即以植物萌发种子作为农杆菌侵染受体，不需进行组织培养和植株再生的植物基因转化方法。
本发明的具体技术方案是以植物萌发种子为受体，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因载体，在植物种子萌发过程中与农杆菌共培养，使其将载体的外源基因片段转移到受体基因组中。将发芽的种子正常播种，并收获转化种子。对转化种子提取DNA进行转化植株的筛选。
为了利于农杆菌Ti质粒进入到受体细胞中，将植物萌发种子进行划伤处理。由于种子经划伤处理后会对种子的生长和发育产生不良影响，生活力下降，因此划伤应适度，仅进行微伤处理。
植物萌发种子与农杆菌的共培养是在浓度为106-108cfu/mL的农杆菌水溶液中进行的。为提高转化率，水溶液中还加入乙酰丁香酮诱导物，使其使用浓度为100μmol/L。
在诱变育种中，通过理化因子处理有可能使生物体产生配子的细胞内遗传物质发生变化。这种人工诱导的突变可以进行稳定的孟德尔式遗传。种子是一幼小的植物雏形，具有天然的形态建成能力和遗传传递能力。因此，育种家常常采用物理的或化学的诱变剂来处理植物的种子，诱发其中的遗传物质突变，并从诱变后代中获得了稳定遗传的优良性状。受此启发，利用生物因子农杆菌作用于植物种子，使其Ti质粒上的T-DNA转移并整合到植物细胞中，从而实现对植物种子的转化，短期内获得转基因植株。
本发明采用农杆菌介导植物萌发种子植物基因转化后，农杆菌介导的外源基因在转化种子产生的植株水平上获得了转移、整合与表达，为农杆菌介导外源基因向植物体中转移提供了一种新的受体系统。
本发明利用植物萌发种子作为农杆菌介导外源基因转化的受体系统，避免了传统农杆菌共培养法所要求的严格的组织培养技术，而且由于种子具有自然的形态建成能力和遗传传递能力，不存在再生植物的困难。同时，本发明不需要涉及昂贵的仪器及复杂的操作技术，利用种子作为受体，获得转化种子的周期大大缩短，并且种子取材方便，不受季节限制。因此，本发明为植物基因的转化提供了一条简便、快速、便宜，更易为人所接受的基因转化新途径。
我们采用本发明的基因转化方法，首先在玉米上进行了遗传转化，并获得了成功。
玉米是重要的粮食作物，其遗传转化在国内外都非常受重视。目前已用农杆菌介导法、基因枪法、电激法、超声波法等方法获得了转基因植株。但是这些方法都需要用愈伤组织甚至是原生质体作为受体进行基因转移，玉米从愈伤组织到分化出再生植物，常出现变异，而且转化植株在从试管移到田间(温室)的过程中也易受损失，如植株夭亡和产生不育株等，使这些方法的应用受到了很大限制。本发明提出的农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，给玉米的遗传转化提供了一种简便、有效的基因转化新技术。
下面是本发明应用于玉米基因转化的一个具体应用实例。
实施例1携带外源基因片段的农杆菌基因供体以携带有质粒pWM101S6的农杆菌EHA101为基因供体材料。质粒pWM101S6携带有抗水稻矮缩病基因(RDV)和抗潮霉素基因hyg(R)，其中hyg(R)基因为选择标记基因，它赋予植物对潮霉素的抗性。抗水稻矮缩病基因的片段大小为1.1kb。质粒pWM101S6的物理图谱如


图1所示。
受体材料以玉米(Zea may,L.)自交系金黄96B，金黄96C,C649,478,海92-1,5003等为受体材料。
转化方法供试玉米种子在室温下正常萌发后，用解剖刀将萌发种子轻轻划伤，划伤标准以50％的种子能正常发芽为适。在划伤种子中加入106-108cfu/mL的农杆菌水溶液，并加入终浓度为100μmol/L乙酰丁香酮，侵染10-12小时后，倾去菌液，换上水溶液，并置于摇床上，进行振荡共培养。经过2-3天的共培养后，将发芽的种子播种于无菌的沙土中进行筛选培养。筛选时选择压为15mg/L潮霉素。经过一周的选择，取幼苗生长健壮、根系生长良好的潮霉素抗性植株移入大田。移入大田的幼苗正常生长，开花时套袋自交。
转化结果按上述转化方法，对供试材料进行了遗传转化处理。共处理不同自交系的萌发种子4500粒，筛选出潮霉素抗性植株75株。其中经潮霉素筛选的植株移入大田后，约80％以上的幼苗能正常成苗。开花时大部分植株表现正常，只有少部分植株出现花期不遇、不能正常散粉等变异。筛选结果见表1。
表1 玉米种子基因转化处理后抗潮霉素筛选结果
转化后的植株正常生长至收获种子后，取一定量的种子发芽，提取总DNA进行分子检测，以确定转化效果。
PCR扩增提取幼苗的总DNA，用琼脂糖凝胶电泳检查DNA提取结果和进行DNA定量。根据RDV基因的核苷酸序列，分别取5′端和3′端20bp的核苷酸对设计引物，进行PCR扩增。
引物合成是由上海生工生物工程公司完成。两引物间的基因片段大小为868bp。PCR扩增用大连宝生物公司的TaKaRTaqTM试剂盒和PTC-200型PCR仪完成。
经过转化处理、抗潮霉素筛选以及自交后共得到转化处理的T1代种子45份，随机地取其中21份进行总DNA提取和PCR扩增。PCR反应程序为94℃4分钟；94℃45秒；50℃45秒；72℃1分45秒，扩增30个循环，然后72℃延伸10分钟。结果得到PCR扩增阳性植株17株，PCR扩增结果详见表2。
表2 PCR扩增结果
图2为PCR扩增产物的部分电泳分析图，图中M为分子量标记；1为C649的未转化单株；2、3、4、5分别为C649的不同转化单株，其中3、4、5为阳性单株；6为质粒阳性对照。
PCR-Southem杂交检测。
对PCR扩增呈阳性的转化植株，参照王关林的方法，提取总DNA，以PCR Dig Probe synthesis Kit标记pWM101S6质粒上的868bp的RDV基因片段为杂交探针，用PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，吸印法转膜。用德国宝灵曼公司的Dig DNA Labeling and Detection Kit进行杂交。杂交温度68℃,CSPD荧光标记，X-光片曝光、显影。结果显示，PCR扩增的17株阳性植株，PCR-Southem杂交检测均呈阳性。
图3是部分阳性植株PCR-Southem杂交检测的结果，图中，1为质粒对照；2为金黄96C未转化单株；3、4、5、6、7、8、9为金黄96C的不同转化单株。
利用本发明方法对玉米自交系进行遗传转化，根据PCR扩增和PCR-Southem杂交检测结果证明，外源基因的确已经导入到受体植物玉米上，并且能够遗传。
进而，我们在小麦上也进行了遗传转化，并已得到转基因抗性植株。
实施例2携带外源基因片段的农杆菌基因供体以携带有质粒pCAMBAR CHI.的农杆菌菌株LBA4404为基因供体材料。质粒pCAMBAR CHI.含有几丁质酶基因(chitinase)和BAR基因，其中BAR基因为选择标记基因，它赋予植物对除草剂草丁膦(有效成份Glufosinate)的抗性。质粒pCAMBAR CHI.的物理图谱如图4所示。
受体材料以小麦(Triticum eestivum L.)品系临远934731，临远93-4736,临远95-5088,G54为受体材料。
转化方法在含有100μmol/L乙酰丁香酮的LB液体培养基中加入LBA4404农杆菌菌株，培养至农杆菌浓度为106-108cfu/mL时成为菌液；小麦种子在水溶液中浸泡数小时，置室温下萌发，萌发时用刀片划伤种子，浸泡于上述菌液中6-8小时，之后再将种子于25℃置于培养皿中共培养3天，播种于蛭石筐盘中；5周后用2‰的除草剂Librity(有效成份Glufosinate)溶液叶面喷洒，筛选到抗除草剂植株。
转化结果按上述转化方法对供试材料进行了遗传转化处理，共处理不同品系的小麦种子6000粒，筛选出抗除草剂植株34株，具体结果见表3。表3 小麦种子基因转化处理后抗除草剂Librity筛选结果
权利要求
1.农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是以植物萌发种子为受体，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因供体，在植物种子萌发过程中与农杆菌共培养，使其将供体的外源基因片段转移到受体基因组中。
2.根据权利要求1所述的基因转化方法，其特征是受体植物萌发种子经划伤处理后再与农杆菌共培养。
3.根据权利要求1、2所述的基因转化方法，其特征是经划伤处理的植物萌发种子经浓度为106-108cfu/mL的农杆菌液侵染以及共培养。
4.根据权利要求3所述的基因转化方法，其特征是菌液中还加入乙酰丁香酮。
5.根据权利要求4所述的基因转化方法，其特征是加入乙酰丁香酮的使用浓度为100μmol/L。
6.根据权利要求1所述的基因转化方法，其特征是用玉米萌发种子进行基因转化。
7.根据权利要求1所述的基因转化方法，其特征是用小麦萌发种子进行基因转化。
全文摘要
本发明是一种利用农杆菌介导植物萌发种子进行基因转化的方法,具体是以植物萌发种于为受体体材料,以携带外源基因片段的衣杆菌Ti质粒为基因供体,在植物种于萌发过程中与农杆菌共培养,使其将供体的外源基因片段转移到受体基因组中的方法。转化结果经PCR扩增和PCR－Southem杂交检测得以证实,证明外源基因片段确已导入到受体材料中,并且能够遗传。
文档编号C12N15/82GK1302900SQ0110418
公开日2001年7月11日 申请日期2001年2月26日 优先权日2001年2月26日
发明者孙毅, 王景雪, 刘少翔, 王卉, 李毅 申请人:山西省农业生物技术研究中心