专利名称：生产赤藓糖醇的Moniliella菌株的制作方法
赤藓糖醇是一种糖醇，其可发现于地衣，大麻叶及蘑菇中，基还可在发酵食品如葡萄酒，大豆酱油或米酒中调味(Sasaki，T.(1989)赤藓糖醇的生产技术，Nippon Nogeikagaku Kaishi 631130-1132)。赤藓糖醇是一种四碳多醇，其具有多种性质如甜味(大约为蔗糖的70-80％)，对牙齿无害，非常低的热量值(0.3kcal/g，蔗糖的十分之一)，无致癌性且不象其它多醇，很少引起胃肠道不适(Harald和Bruxelles(1993)Starch/Starke 45400-405)。
传统的赤藓糖醇工业生产是通过将催化剂如氢与镍加入原料糖中，在高温高压环境下生产。另一种方法是通过化学还原原料如中酒石酸盐(Kent，P.W.和Wood，K.R.(1964)J.Chem.Soc.2493-2497)或赤藓糖(Otey，F.H.和Sloan，J.W.(1961)Ind.Eng.Chem.53267)以获得赤藓糖醇。另外，赤藓糖醇可通过许多微生物生产，这些微生物包括高嗜高渗酵母例如毕赤氏酵母(Pichia)，假丝酵母(Candida)，球拟酵母(Torulopsis)，三角酵母(Trigonopsis)，Moniliella，短柄霉(Aureobasidium)，及丝孢酵母(Trichosporon)菌种(Onishi，H.(1967)Hakko Kyokaish 25495-506；Hajny等(1964)Appl.Microbiol.12240-246；Hattor，K.和Suziki，T.(1974)Agric.Biol.Chem.381203-1208；Ishizuka，H.等(1989)J.Ferment.Bioeng.68310-314)。
本发明涉及分离的Moniliella菌种的菌株，其具有增强的将葡萄糖转化为赤藓糖醇的能力，这种菌株在最佳条件下能以至少大约35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％或更高的转化率从葡萄糖中生产赤藓糖醇。
本发明的菌株包括天然来源的Moniliella分离株；及Moniliella菌株的突变体例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)中登记号为PTA-1227，PTA-1228，PTA-1229，PTA-1230及PTA-1232的Moniliella菌株。一特殊的突变体菌株是分离株N61188-12，保藏在美国典型培养物保藏中心，登记号PTA-2862。
本文所用术语“突变体”是指一种菌株，其遗传组成与参照菌株或亲代菌株至少有一个核苷酸不同，例如取代，插入或缺失。本发明的突变体可通过许多方法产生，一种方法是选择相对于亲代菌株有增高的赤藓糖醇转化率的菌株，此菌株可通过随机诱变亲代菌株而获得，例如通过化学诱变剂，转座子或辐照。另外，本发明的突变体菌株可包括重组核酸序列，例如，突变体可以是一种含有一额外的核酸序列的菌株，所述序列例如为转化，转导或以其他方式插入亲代菌株细胞中的序列。此额外的核酸序列可编码一般性表达或条件表达的多肽。或者，此额外的核酸序列可编码能改变细胞生理学的核酸序列，例如反义，核酶，或其它核酸序列。另一种情况中，插入的核酸插在内源性基因中并改变(例如增强或破坏)其功能。例如，插入的核酸可以是失活内源性基因的剔除构建体；或是提高内源性基因转录的人工增强子或启动子。这类突变可破坏亲代菌株输出、同化或消耗赤藓糖醇或甘露糖醇的能力。
本发明还涉及一种生产赤藓糖醇的方法，该方法包括在培养基中培养本发明的Moniliella菌株，例如一种增强的突变体；并从培养物中纯化赤藓糖醇，例如从上清或细胞沉淀中纯化。
本发明的一或多个实施方案在附图
及下文中加以详细阐述，本发明的其它特点，目的及优点从以下阐述，附图及权利要求中将显而易见。
真菌Moniliella能发酵简单糖产生赤藓糖醇，赤藓糖醇是许多烹饪法使用的非常好的调味品。使用筛选和诱变鉴别能高效生产赤藓糖醇的改良的Moniliella菌株，这种菌株可理想地用于大规模生产赤藓糖醇，这一点通过本发明所举例说明的方法获得。增强的赤藓糖醇生产菌株的分离如申请日2000年6月2日的美国专利申请09/585,926所述可从天然来源中获得Moniliella分离株。例如，Monilella分离株可得自高糖含量的天然来源，包括蜂蜜，蜜饯及花粉。基于其将葡萄糖转化为赤藓糖醇的能力及其各种形态学和生理学特性鉴别各菌株，文中所用的术语“葡萄糖至赤藓糖醇转化率”是指产生的赤藓糖醇量除以消耗的葡萄糖的量，所得比值以百分数表示，真菌菌株的葡萄糖至赤藓糖醇转化率可通过以下方法计算，此菌株首先在50ml烧瓶中的含有30％葡萄糖和1％酵母提取物(初始细胞密度1×105个细胞/ml)的10ml肉汤中在摇床中以150rpm，在30℃培养6天，然后确定培养基中赤藓糖醇浓度及葡萄糖浓度。1g葡萄转化为0.3g赤藓糖醇则转化率为30％。在4％麦芽提取物，0.5％酵母提取物琼脂上，在20℃培养10天确定形态学特征。参见由Kurtzman等编辑的《酵母分类学研究》，第4版，第785页，Elsevier，阿姆斯特丹(1998)。
Moniliella菌株突变体可通过Ishizuka等(1989)J.Ferment.Bioeng.68310-314所述诱变法，或所述方法的改进方法(参见美国专利No.5,036,011)获得。如下阐述了一种用N-甲基-N-亚硝基胍(NTG)诱变Moniliella细胞的变化方法，将Moniliella细胞接种在具有30％葡萄糖和1％酵母提取物的肉汤中，并在摇床上以150rpm在30℃培养过夜。此培养物以1∶100稀释在含有30％葡萄糖的10ml肉汤中，并在摇床上以150rpm在30℃培养1天。此培养肉汤以3000rpm离心15分钟，以形成细胞沉淀并弃去上清。此细胞沉淀用10ml无菌0.1M pH7.0磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，离心(3000rpm，15分钟)悬浮液并再弃去上清。细胞重悬浮于具有150μg/ml NTG的PBS中10分钟。
在用NTG处理后，Moniliella细胞在葡萄糖溶液中培养3小时，然后适当稀释培养物并涂布于含有65％葡萄糖的培养基上，在30℃培养6天。随机选择菌落，接种于含30％葡萄糖的肉汤中，并在摇床上以150rpm在30℃培养过夜。将过夜培养物的1∶100稀释液用于接种30％葡萄糖溶液(10ml)，在摇床上以150rpm在30℃培养4天，此培养物的培养基然后以12000rpm离心10分钟，适当稀释上清，并用DNS法(见下文)测定剩余葡萄糖量。具有较高葡萄糖消耗量(即低葡萄糖剩余量)的培养物被进一步分析以确定赤藓糖醇产量，下文所述HPLC法可用于确定赤藓糖醇产量。表明有高赤藓糖醇产量的培养物进行进一步检定，例如，获得用于培养的各个菌落，如上述再培养，并再分析。选择的菌落根据这些方法的额外诱变循环可加以改良。测定剩余葡萄糖收集4天培养物肉汤，并以12000rpm离心10分钟。适当稀释上清，1ml每份稀释液加入0.5ml DNS(二硝基水杨酸)试剂中。制备DNS试剂(例如a.1％3，5-二硝基水杨酸(DNS)；b.0.2％苯酚；c.0.05％NaHSO3或0.025％Na2S2O3；d.1％NaOH；e.0.5％酒石酸钾钠四水合物)，并根据Miller，G.L.(1958)分析化学(Anal.Chem.)31426-428所述使用。此混合物充分混合后在100℃保温5分钟。在室温下冷却后，加入9ml水并确定在540nm的吸光度(OD540nm)。在540nm的吸光度用于与标准曲线相比确定葡萄糖浓度，标准曲线是通过测定各种浓度纯葡萄糖而得到的。测定赤藓糖醇浓度上清中赤藓糖醇量可通过HPLC及TLC确定，以例如确定菌株生产赤藓糖醇能力。HPLC分析使用Hewlett Packard H4033A分析仪，在Ion-300层析柱上，用0.1N硫酸作为流动相，流速0.4ml/min，温度设定为75℃。TLC分析用的是Neissner等所述方法(Neissner等，1980，Herstellung，aanalysc und DC-trennung von fettsaureerythritpartialestern.FETTE SEIFEN ANSTRICHMITTEL.8210-16)，在用4％硼酸漂洗Kieselgel 60F254(Merck)之后，在使用之前将此凝胶在培养器内在105℃加热20分钟。展开溶剂是甲基乙基甲酮∶丙酮∶水(100∶10∶10(体积比))，显色剂是浓缩硫酸中的KMnO4。
通过HPLC或TLC纯化自上清的赤藓糖醇可通过提取进一步纯化，然后减压干燥。根据Shindou等(Shindou等，1989，J.Agric.FoodChem.271474-1476)的方法，将进一步纯化的产物及赤藓糖醇标准乙酰化。赤藓糖醇标准可商购，例如购于Merck，德国。所得样本可通过GC-MS分析以确定再纯化产物是否等同于标准样本。大规模生产赤藓糖醇通过以下所提供的具体实施例，本领域技术人员通过鉴别优选的pH，温度和生长和发酵所需的碳源，可以优化突变Moniliella菌株的赤藓糖醇产量。相似的分析可用于优化通气，搅拌速度，培养体积及培养时间。
为大规模生产赤藓糖醇，将保存在甘油中的0.2ml Moniliella细胞加入500ml烧瓶中的50ml肉汤中，并在摇床上以150rpm在30℃培养大约24小时。用2ml的此培养物接种第二个500ml烧瓶中的50ml肉汤。第二个培养物在摇床上以150rpm在30℃培养48小时。用第二个培养肉汤接种5L发酵罐(NBS.Edison，New Jersey，美国)中的2L肉汤。培养条件如下通气1VVM；搅拌速度500rpm；温度30℃；培养时间5-7天。为此，肉汤可由30％，35％，40％，45％，或50％葡萄糖与1％酵母提取物一起组成。另外，KM72和KM72F(Shin Etsu，Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.6-1，Ohtemachi 2-chome，Chiyoda-ku，东京，日本)可用作消沫剂。纯化赤藓糖醇离心发酵罐中的培养基以分离培养物上清与沉淀细胞。通过活性碳(例如，可得自地方供应商的粉末碳)将上清脱色。将脱色的上清通过连续经过阳离子交换树脂，DIAION，WA30(Mitsubishi)及阴离子交换树脂，AMBERLITE IR 120NA(Rohm and HaasCompany)脱盐并脱蛋白。所得溶液用以下装置浓缩EYELA RotaryVacuum Evaporator N-N系列；EYELA Waterbath SB-450；及EYELA，Aspirator A-3(Tokyo Rikakikai Co.LTD)，浓缩的溶液在室温结晶。晶体任选地用含水乙醇及水(例如在4℃)冲洗或在其中重结晶以除去痕量杂质。检定赤藓糖醇纯化为证实纯化产物的化学性质，将纯化产物的NMR谱与标准赤藓糖醇的NMR谱相对比，标准赤藓糖醇例如可购自MerckCo.(NJ.USA)，或其它商品供应商。样本溶于100％D2O中并置于NMR光谱仪(Bruker AM-500，德国)中。以下条件用于1H NMR谱400.135MHz；脉冲长度4.0μs；取数时间1.245秒；脉冲延迟1秒；化学位移D2O作为0ppm。以下条件用于13C NMR谱L100.536MHz；脉冲长度5.0μs；取数时间0.623秒；脉冲延迟2秒；化学位移10mM DSS作为0ppm。
本领域技术人员根据以下特异实施例可获得本发明的真菌突变体，并用其最大程度地生产赤藓糖醇，以下实施例只是举例说明本发明而非限制本发明范围。本文所引证的所有文献均并入参考。
实施例分离Moniliella突变体生产赤藓糖醇的真菌Moniliella PTA-1230用NTG通过上述方法诱变。重复进行诱变步骤，即前一轮分离的改良赤藓糖醇生产菌用作下一轮的亲代菌株。在6轮诱变后分离出N61188-12突变菌株(ATCC保藏号PTA-2862)。
N61188-12突变菌株和亲代PTA-1230均在含有35％葡萄糖和1％酵母提取物的肉汤中，在摇床上以150rpm，在25℃，30℃，34℃和37℃培养6天。在每个温度，对N61188-12突变菌株而言葡萄糖至赤藓糖醇转化率分别为43.9％，61.4％，17.8％，和2.2％，对亲代PTA-1230而言转化率分别为18.9％，30,5％，17.9％和7.7％。在25℃和30℃，N61188-12菌株的赤藓糖醇产量是PTA-1230的至少2倍。观测到的N61188-12菌株61.4％的产量是意想不到的，因为其明显地接近完全葡萄糖至赤藓糖醇转化率的理论上限68％。
为检定之目的，纯赤藓糖醇用上述方法得自N61188-12菌株的发酵罐培养物。得自N61188-12的纯赤藓糖醇通过上述核磁共振分析，其波谱与标准赤藓糖醇的波谱一致表明回收、纯化及结晶的产物是所需赤藓糖醇。优化生产赤藓糖醇的条件在变化pH，温度(见上述)及碳源的条件下，平行确定亲代PTA-1230与N61188-12菌株的赤藓糖醇产量。
pH亲代PTA-1230和N61188-12菌株在含有35％葡萄糖和1％酵母提取物的各种pH值肉汤中，在摇床上以150rpm在30℃培养6天。在pH为3.0，4.0，5.0，6.0及7.0时，PTA-1230的赤藓糖醇的产量分别为31.2％，39.3％，38.4％，34.4％和34.2％，而N61188-12菌株的赤藓糖醇产量分别为56.6％，59.4％，58.5％，60.3％和57.3％。
葡萄糖浓度制备含有20％，30％，35％，40％和50％葡萄糖与1％酵母提取物的培养肉汤。PTA-1230和N61188-12菌株均在上述肉汤中在摇床上以150rpm在30℃培养6天。在每个葡萄糖浓度，PTA-1230菌株的赤藓糖醇产量分别为40.6％，37.1％，34.5％，29.4％和19.2％，而N61188-12菌株的赤藓糖醇产量分别为56.3％；57.5％，62.8％，55.6％和35.8％(表1)。PTA-1230菌株的最大产量是用20％葡萄糖溶液获得，随着葡萄糖浓度提高，产量降低。N61188-12菌株的最大产量是用含35％葡萄糖的肉汤获得，得自其它葡萄糖浓度如20％，30％和40％的葡萄糖溶液的产量彼此相近，而得自50％葡萄糖溶液的产量降低至35.8％。在高葡萄糖浓度例如40％和50％，N61188-12菌株的赤藓糖醇产量是PTA-1230产量的近2倍。这些结果表明N61188-12菌株与野生型PTA-1230菌株相比，赤藓糖醇的生产能力意想不到地改良了。
碳源制备含有作为碳源的35％葡萄糖，麦芽糖糊精、麦芽糖、蔗糖、果糖或乳糖，及作为氮源的1％酵母提取物的培养肉汤。PTA-1230和N61188-12菌株均在以上肉汤中在30℃在摇床上以150rpm培养6天。在含有葡萄糖，麦芽糖糊精，麦芽糖，蔗糖，果糖或乳糖的肉汤中培养，PTA-1230菌株分别产生120.8，44.5，0，154.0，111.0及0g/L赤藓糖醇，而N61188-12菌株分别产生222.0，15.1，22.8，239.4，211.4及0g/L赤藓糖醇。这些结果表明对这二个真菌菌株而言，蔗糖具有最佳的转化率，接下来是葡萄糖，然后是果糖。值得注意的是，PTA-1230菌株不能利用麦芽糖和乳糖生产赤藓糖醇，而N61188-12菌株能利用麦芽糖，但不能利用乳糖生产赤藓糖醇。对PTA-1230菌株而言，用蔗糖作碳源比用葡萄糖作碳源获得的赤藓糖醇产量高27.5％，而对N61188-12菌株而言，相同条件下赤藓糖醇产量只高9％。
副产物积累监测在前述碳源中代谢副产物-甘油，戊五醇及乙醇的浓度。例如，当葡萄糖用作碳源时，PTA-1230菌株培养肉汤中甘油和戊五醇的浓度分别是36.4和17.2g/L，而N61188-12菌株培养肉汤中没有甘油，且戊五醇的含量仅为3.8g/L。其它碳源的结果见表1。
在用葡萄糖作碳源发酵PTA-1230菌株期间，没有乙醇产生。但在其它碳源中，PTA-1230及N61188-12菌株在接种后开始5天均有乙醇产生，然而在第6天乙醇耗尽。唯一的例外是当果糖用于N61188-12培养时，在第6天仍有一些残余乙醇(0.7g/L)。总而言之，这些结果表明使用蔗糖培养N61188-12菌株产生的赤藓糖醇转化率高而不累积副产物。
表1PTA-1230和N61188-12菌株的赤藓糖醇产量及副产物产量
每种碳源以35％存在；氮源为1％酵母提取物；并以150rpm培养6天。
突变菌株N61188-12的总性质亲代PTA-1230菌株和突变体N61188-12菌株在各种条件下生长并对比。其细胞形态基本相同，然而在平板上，突变菌株只生长为PTA-1230菌株大小的1/4。此两种菌株具有不同的生理学性质，这些不同反映在其发酵及同化不同糖的能力中。突变体N61188-12菌株能发酵半乳糖(表2)，而PTA-1230菌株不能。另外，与PTA-1230菌株相反N61188-12菌株不能同化赤藓糖醇和甘露糖醇(表3)。
表2.各种碳源的发酵
表3 PTA-1230和N61188-12菌株在不同碳源的同化分析
W*是指弱生长和对碳源的meager同化。
细胞密度在各种条件如温度，pH，碳源及葡萄糖浓度下，N61188-12菌株培养肉汤的浊度(A660)小于PTA-1230菌株的培养肉汤的浊度。除用麦芽糖及乳糖作碳源外，整体上N61188-12菌株培养肉汤的浊度是PTA-1230菌株的31％-77％。在大多数情况中，N61188-12菌株的浊度是PTA-1230菌株浊度的50％以下。因此，这意味着N61188-12菌株降低了用于细胞生长的碳源比例，而代以将碳源高比例地转化为赤藓糖醇。其它实施方案已阐述了本发明的许多实施方案，然而应知道在不偏离本发明精神及范围之内可以做各种修改。由此，其它实施方案在以下权利要求范围内。
权利要求
1.一种分离的Moniliella菌株，其中此菌株以至少大约45％的转化率将葡萄糖转化为赤藓糖醇。
2.权利要求1的分离的菌株，其中此菌株以至少大约50％的转化率将葡萄糖转化为赤藓糖醇。
3.权利要求2的分离的菌株，其中此菌株以至少大约60％的转化率将葡萄糖转化为赤藓糖醇。
4.权利要求1的分离的菌株，其中此菌株是Moniliella菌株PTA-1227的突变体。
5.权利要求1的分离的菌株，其中此菌株是Moniliella菌株PTA-1228的突变体。
6.权利要求1的分离的菌株，其中此菌株是Moniliella菌株PTA-1229的突变体。
7.权利要求1的分离的菌株，其中此菌株是Moniliella菌株PTA-1230的突变体。
8.权利要求1的分离的菌株，其中此菌株是Moniliella菌株PTA-1232的突变体。
9.权利要求7的分离的菌株，其中此菌株是N61188-12，保藏在美国典型培养物保藏中心，登记号为PTA-2862。
10.一种生产赤藓糖醇的方法，所述方法包括培养权利要求1的Moniliella菌株；并从培养物中纯化赤藓糖醇。
11.一种生产赤藓糖醇的方法，所述方法包括培养权利要求2的Moniliella菌株；并从培养物中纯化赤藓糖醇。
12.一种生产赤藓糖醇的方法，所述方法包括培养权利要求3的Moniliella菌株；并从培养物中纯化赤藓糖醇。
13.一种生产赤藓糖醇的方法，所述方法包括培养权利要求4的Moniliella菌株；并从培养物中纯化赤藓糖醇。
14.一种生产赤藓糖醇的方法，所述方法包括培养权利要求5的Moniliella菌株；并从培养物中纯化赤藓糖醇。
15.一种生产赤藓糖醇的方法，所述方法包括培养权利要求6的Moniliella菌株；并从培养物中纯化赤藓糖醇。
16.一种生产赤藓糖醇的方法，所述方法包括培养权利要求7的Moniliella菌株；并从培养物中纯化赤藓糖醇。
17.一种生产赤藓糖醇的方法，所述方法包括培养权利要求8的Moniliella菌株；并从培养物中纯化赤藓糖醇。
18.一种生产赤藓糖醇的方法，所述方法包括培养权利要求9的Moniliella菌株；并从培养物中纯化赤藓糖醇。
全文摘要
本发明公开了以至少大约45%的转化率将葡萄糖转化为赤藓糖醇的Moniliella菌种的分离株,以及从这种菌株生产赤藓糖醇的方法。
文档编号C12P7/18GK1369549SQ0110376
公开日2002年9月18日 申请日期2001年2月12日 优先权日2001年2月12日
发明者朱文深, 林锡杰, 温秋燕, 黄章诚 申请人:食品工业发展研究所