专利名称：从乳化组合物中提纯核酸的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸提纯方法及其应用，尤其是指一种从乳化组合物中提纯核酸的方法及其应用。
背景技术：
核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类。小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)和微小 RNA (microRNA,miRNA)是一类长度在 22nt 左右、能调控基因表达的小分子RNA，能通过与靶基因的信使RNA (message RNA, mRNA)结合，阻断或抑制mRNA的转录，从而发挥转录后基因调控的功能。不仅广泛应用于生物医学研究，而且在治疗多种疾病如病毒感染、肿瘤、血管神经系统疾病等具有广阔的前景。近年来，在治疗皮肤相关疾病的研究中，用siRNA或miRNA抑制皮肤中某些基因的表达，获得了很好的治疗效^ ο目前核酸提纯方法有主要分为两大类一种是从生物材料中通过裂解破碎的方法提取纯化核酸，另一种为从复杂的组合物中分离纯化出核酸。现有的从生物材料中提取核酸主要是用强变性试剂或生物酶破坏生物屏障，如细胞壁、细胞膜或细胞核膜，从而将DNA或RNA提取出来，然后再通过后期的纯化，最后得到纯的核酸。从组合物中分离纯化核酸，主要是通过物理的方法，如用硅胶吸附膜将核酸吸附在固相上，然后进行分离纯化。P. D. Siebert和A. Chenchik等用异硫氰酸胍裂解细胞，然后在酸性条件下用苯酚除去共价的 DNA，从而提纯出细胞中的 RNA (Nucleic Acids Res. , 21，2019-2020 (1993))。 还有利用硫氰酸胍或类似的盐溶液来裂解细胞，还有通过溶菌酶等裂解细胞，然后通过乙醇沉淀的方法或是能吸附核酸的二氧化硅及类似物来纯化核酸(R. Boom等，J. Clin. Microbiol. , 28, 495-503 (1990))。用于核酸提取的酚氯仿异丙醇试剂，其体积比为为25 24 :1，其中酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去。氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质。核酸易溶于水，不溶于有机溶剂。氯仿可以加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的过量酚(酚易溶于氯仿中)。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，核酸存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去核酸溶液中的酚。在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异0.6倍的丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。异丙醇沉淀的效果要好一些，但最后大多用乙醇沉淀，因为乙醇容易挥发，对下游的实验影响小。用乙醇或异丙醇来沉淀核酸的机理是，核酸溶液是核酸以水合状态稳定存在，当加入乙醇或异丙醇时，乙醇或异丙醇会夺去核酸周围的水分子，使核酸失水而易于聚合。异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇
3的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。异丙醇的优点为所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大的DNA样品的沉淀。0. M 1. 0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA ；但对kRNA、tRNA 和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。缺点易使盐类(如NaCl、 蔗糖)与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70%的乙醇漂洗 DNA沉淀数次。乙醇是沉淀DNA的首选有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95%乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2. 5倍。缺点是总体积较大。需在_20°C放置较长时间，0. 5 lh。要得到较纯的核酸，需要70%乙醇洗涤。糖原用来作为沉淀辅助剂(Tracy,S.，ft·印.Biochem. , 11, 251-268 (1981))，在乙醇或异丙醇存在的情况下，可以与核酸共同沉淀下来，可以增加沉淀物的体积，能够帮助回收低浓度的核酸，并且糖原不会影响核酸的活性和吸光值。醋酸钠溶液有促进核酸沉淀的作用，核酸带负电荷，加一定浓度的醋酸钠，使钠离子中和核酸分子上的负电荷，减少核酸分子之间的同性电荷排斥力，易于互相聚合而形成核酸钠盐沉淀。低PH值的醋酸钠溶液降低了反应混合物中的PH值，起到中和作用，从而使核酸复性，并核酸容易聚集。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种核酸提纯方法，尤其是指一种从乳化组合物中提纯核酸的方法。本发明的技术解决方案是将含核酸的乳化组合物高温加热成乳液状，在其中加入2倍体积的酚氯仿异戊醇试剂，涡旋振荡混勻，经高速离心后取上清液，加入2. 5倍体积的乙醇及沉淀辅助试剂，混合均勻，置低温沉淀，经高速离心后弃上清液，除尽残余乙醇， 用无核酸酶的水或缓冲液充分溶解沉淀后进行检测。本发明所述的核酸是核糖核酸(RNA)或是脱氧核糖核酸(DNA)，在一实施方式中， 该核酸是一种小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)，该小干扰RNA具有基因沉默的作用。在另一实施方式中，该核酸是一种微小RNA (microRNA，miRNA)，该微小RNA具有调节基因表达的作用。在其它一些实施方式中，该核酸是一类具有调节基因表达的非编码 RNA (non-coding RNA, ncRNA)0在一个优选的实施方式中，上述的乳化组合物包括化妆品和药用软膏制剂。所述的化妆品中含具有基因调控作用的核酸，局部外用，可抑制人体皮肤细胞中使皮肤变黑的黑色素和其它色素的基因表达，减少色素的含量和沉着，从而达到美白和祛斑的作用。所述的药用软膏制剂中含具有基因调控作用的核酸，该类软膏制剂能在长时间内紧贴、粘附或铺展在用药部位，既可以起局部治疗作用，也可以起全身治疗作用。在一具体实施方式
中，上述的具有美白祛斑效果的化妆品可以是水包油型或油包水型乳化组合物。上述的酚氯仿异戊醇试剂，其体积比为25:24:1，pH值为4. 5 8. 0。乙醇可以为无水乙醇，也可以为95%乙醇。在一实施方式中，可用0. 6倍体积的异丙醇代替2. 5倍体积的乙醇，预冷的异丙醇和乙醇较适用。所述的沉淀辅助试剂是醋酸钠溶液和糖原，其特征在于，醋酸钠溶液的浓度为3 mol/L，糖原的浓度为10 mg/mL或其它可以适用的浓度。所述的溶解沉淀的缓冲液可以是TE Buffer (IOmM Tris-HCl,lmM EDTA pH = 8. 0)。上述的检测包括凝胶电泳分析检测和高效液相色谱分析检测，在一实施方式中， 用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。本发明可以方便快速地从乳化组合物中提纯出核酸，核酸提取率为80 99%，纯度可以达到高效液相色谱分析级别。本发明的另一目的在于提供上述方法在乳化组合物或类似物的核酸提纯中的运用。
图1是从4种乳化组合物提纯的核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。图中，1为标准对照核酸，2为乳化组合物06M01中提纯的核酸，3为乳化组合物06M02中提纯的核酸，4 为乳化组合物06M03中提纯的核酸，5为乳化组合物06M04中提纯的核酸。图2是从4种乳化组合物提纯的核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。图中，1为标准对照核酸，2为乳化组合物091101中提纯的核酸，3为乳化组合物091102中提纯的核酸，4 为乳化组合物091103中提纯的核酸，5为乳化组合物061303中提纯的核酸。图3是从乳化组合物061303中提纯的核酸高效液相色谱分析图谱。图4是从乳化组合物091101中提纯的核酸高效液相色谱分析图谱。图5是从乳化组合物091102中提纯的核酸高效液相色谱分析图谱。图6是从乳化组合物091103中提纯的核酸高效液相色谱分析图谱。图7是乳化组合物对照提纯后的高效液相色谱分析图谱，乳化组合物对照是指不含有核酸的乳化组合物，将其按照核酸提纯步骤提纯后进行高效液相色谱分析。
具体实施例方式本发明中术语的定义应该用来解释包含没有详述的此领域中的相关术语，并非是对本发明进行限制。本发明中术语“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，可以是单链或双链的结构形式。该术语包括熟知的核苷酸类似物或修饰的后键残基或连接，可以是人工合成的、天然的和非天然的，含有与核酸类似的结合性质和新陈代谢性质。本发明中所述的小核酸是具有基因调控作用的一类非编码RNA，该类非编码RNA 主要包括siRNA和miRNA。siRNA或miRNA分子进入细胞内，靶向结合到功能基因，发挥基因调控的作用，可以阻断或抑制靶基因的表达。
出于应用目的，将核酸(尤其是小核酸，如SiRNA或miRNA)添加到乳化组合物中， 作为一种化妆品，局部外用，可抑制人体皮肤细胞中使皮肤变黑的黑色素和其它色素的基因表达，减少色素的含量和沉着，从而达到美白和祛斑的作用。本发明中术语“乳化组合物”和“乳化物”可以互换，其表示的意思和范围相同。还可以作为一种药用软膏制剂，如具有皮肤病防治和治疗效果的软膏剂，局部外用，可以用来治疗高色素病，如黄褐斑、黑变病、炎症后色素沉着等。本发明中所述的乳化组合物主要成份是油脂、多元醇、核酸等。本发明涉及的乳化组合物中不含有抑制核酸功能和降解破坏核酸分子结构的成份。为了实现本发明的设计思想并验证核酸提纯效果，设计了如下实验方案 1.将乳化组合物在80°C水浴锅中高温加热，使其成乳液状。2.取适量乳液状乳化组合物，在其中加入2倍体积的酚氯仿异戊醇试剂，涡旋振荡充分混勻。3.高速离心使其分层后，取上清液。4.在上清液中，加入2. 5倍体积的乙醇及沉淀辅助试剂，混合均勻，置于-20°C沉淀0. 5 3 h或置于-80°C沉淀0. 5 2 h。5.经高速离心后弃上清液，除尽残余乙醇，用无核酸酶的水或缓冲液充分溶解沉淀，必要时可在55 60°C促溶。6.用聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱分析法进行定量检测。以下结合实施例对本发明做进一步阐明。下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。实施例1
核酸提纯用试剂及仪器和材料 1、试剂
1. 1 焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)处理水(简称DEPC_H20) 加0. 1% DEPC到去离子水中，混勻过夜，121°C /20 min高压灭菌，分装到离心管中备用。1.2 酚氯仿异戊醇试剂(酚氯仿异戊醇的比例为25:24:1) 1.3 无水乙醇
1. 4 3 mol/L 醋酸钠溶液(pH = 5. 2)
称取40. 8 g三水醋酸钠(NaOAc · 3H20)于烧杯中，加80 mL DEPC-H2O,用冰醋酸调pH 值至5. 2，用DEPC-H2O定容到100 mL, 121 °C /20 min高压灭菌，常温保存备用。1. 5 10 mg/mL 糖原
称取10 mg的糖原于烧杯中，加DEPC-H2O定容到1 mL，用0. 22 μΜ过滤膜过滤，常温
保存备用。1.6 6 X上样缓冲液
量取6 mL乙二胺四乙酸(EDTA) (500 mM, pH = 8. 0)加入到约50 mL DEPC-H2O中，再加入1 g溴酚蓝，量取36 mL丙三醇，用2 N氢氧化钠调pH至7.0，定容至100 mL，4°C保存
1.7 40%聚丙烯酰胺储液
称取丙烯酰胺固体四0 g置于烧杯中，再称取10 g甲叉双丙烯酰胺，加入约500 mL DEPC-H2O,充分搅拌，溶解完全后定容至1 L，用0.45 μ m滤纸过滤，转移棕色瓶中，4°C避光
保存备用。1. 8 10% 过硫酸铵(ammonium per sulfate，AP)
称取1 g的AP置于烧杯中，加DEPC-H2O至100 mL,充分混勻溶解，4°C保存备用。1.9 15 %聚丙烯酰胺凝胶
量取18. 75 mL 40%聚丙烯酰胺储液，加20 mL DEPC-H2O,再加入200 μ L的10% AP和 40 μ L的四甲基乙二胺，用DEPC-H2O补足到50 mL,混勻后灌制到制胶设备中凝固备用。1. 105 X TBE 缓冲液
称取 Tris 碱 53. 88 g，EDTA 固体 2. 93 g 或 Na2EDTA*2H20 固体 3. 72 g，H3BO3 27.5 g 置于烧杯中，加入约700 mL的DEPC-H2O,溶解完全，调pH至8. 3，定容至1 L，室温保存备用。1. 11核酸染色剂
称取1 g溴化乙锭于专用容器中，加入100 mL的DEPC-H2O,搅拌数小时至完全溶解， 转移至棕色瓶中，4°C避光保存备用。1. 12 IM Tris-HCl (pH = 8. 0)
称量121. 1 g Tris置于1 L烧杯中，加入约800 mL的DEPC-H2O,充分搅拌溶解。用浓盐酸调节PH值为8.0。1. 13 TE 缓冲液
量取 5 mL 的 IM Tris-HCl (pH = 8. 0)禾口 1 mL 的 0. 5 M EDTA (pH = 8. 0)，向烧杯中加入约400 mL的DEPC-H2O均勻混合；将溶液定容到500 mL后，121°C/20 min高压灭菌； 室温保存备用。注上述DEPC-H2O可用无核酸酶的水代替，如Milli-Q水。2、仪器和材料
2. 1无核酸酶1. 5 mL离心管 2. 2不同规格的移液吸头 2. 3离心管架
2. 4不同量程的单道可调移液器
2. 5恒温水浴锅
2. 6高速离心机
2. 7-80°C超低温冰箱
2. 8电泳仪及聚丙烯酰胺凝胶制胶设备
2. 9核酸染色缸
2. 10凝胶成像系统
实施例2
从乳化物中提纯小核酸实验步骤如下
1、预先将恒温水浴锅调节到80°C，将适量乳化物置于1. 5 mL离心管中，并放到水浴锅中加热5 min，使乳化物成乳液状。
2、取300 μ L乳化物，加入100 μ L的DEPC_H20。混勻后加入2倍体积的酚氯仿异戊醇试剂，涡旋振荡混勻，置于高速离心机中，13，000 rpm离心5 min。将上清液转移至另一干净1. 5 mL离心管中，加入2. 5倍体积的无水乙醇，1/10体积的3 mol/L的醋酸钠溶液，混合均勻，置于_80°C超低温冰箱约1 h。取出置于离心机，13，000 rpm离心20 min。 弃掉上清液，吹干残余乙醇。加入约10 PL的DEPC-H2O充分溶解沉淀。3、在溶解后的样品中，加入2 UL 6X上样缓冲液，混勻。4、在IXTBE缓冲体系中，用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，300 400 V电压，电泳约1 2 h。将已知浓度的核酸标准品同时进行电泳分离。5、电泳结束后，将凝胶取下置于核酸染色剂中染色。凝胶成像系统观察，并测定图像的灰度值，计算核酸的含量。核酸含量计算公式如下
核酸含量=标准品核酸含量X待测样品的灰度值/标准品灰度值 6、结果分析如下
如图1所示，从4种不同乳化物中成功提纯出了核酸，在这些乳化物中含有两种小核酸，其经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，显示两种小核酸的迁移条带，说明提纯出的核酸保持了很好的完整性。用图像分析软件，分析计算凝胶图像的灰度值，经过与核酸标准品的相比较，其4 种乳化物的小核酸含量提取率分别为93. 2%,93. 7%,92. 7%,98. 3%。 实施例3
从乳化物中提纯小核酸实验步骤如下
1、预先将恒温水浴锅调节到80°C，将适量膏霜置于1. 5 mL离心管中，并放到水浴锅中加热5 min，使膏霜成乳液状。2、取900 μ L乳液状膏霜，加入300 μ L的DEPC-H2O，混勻后，平均分装到3个1. 5 mL的离心管中，400 μ L/管。每管中加入2倍体积的酚氯仿异戊醇试剂，涡旋振荡混勻，置于高速离心机中，13，000 rpm离心5 min。将上清液转移至另一干净1. 5 mL离心管中，加入2. 5倍体积的无水乙醇，1/10体积的3 mol/L的醋酸钠溶液，1. 5 μ L的10 mg/mL 糖原，混合均勻，置于_80°C超低温冰箱约1 h。取出置于离心机，13，000 rpm离心20 min。 弃掉上清液，吹干残余乙醇。加入约10 PL的DEPC-H2O充分溶解沉淀。3、在溶解后的样品中，加入2 UL 6X上样缓冲液，混勻。4、在IXTBE缓冲体系中，用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，300 400 V电压，电泳约1 2 h。将已知浓度的小核酸标准品同时进行电泳分离。5、电泳结束后，将凝胶取下置于核酸染色剂中染色。凝胶成像系统观察，并测定图像的灰度值，计算小核酸的含量。核酸含量计算公式如下
核酸含量=标准品小核酸含量X待测样品的灰度值/标准品灰度值 6、结果分析如下
如图2所示，从4种不同乳化物中成功提纯出了核酸，在这些乳化物中含有两种小核酸，其经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，显示两种小核酸的条带，说明提纯出的核酸保持了很好的完整性。用图像分析软件，分析计算凝胶图像的灰度值，经过与核酸标准品的相比较，其4 种乳化物的小核酸含量提取率分别为98. 5%,95. 5%,92. 4%,96. 5%。实施例4
高效液相色谱法分析提纯后的核酸纯度 1、色谱条件 1.1仪器
岛津 HPLC (System Controller :SIL-20A ；Pump LC-20AT ；Detector :SPD_20A) 1. 2 色谱柱DNA Pac PA-100 (美国 DIONEX 公司)
1.3流动相
A 1 mM Tris + 10 mM NaClO4 pH = 7. 4士0. 1 B 1 mM Tris + 10 mM NaClO4 pH = 7. 4士0. 1
A 称取 Tris (美国 BBI 公司)0· 122 g, NaClO4 ‘ H2O (上海生工)1. 404 g，加 Milli-Q 水适量使溶解，用HCl、NaOH调节pH至7. 4，加MiIli-Q水至1000 mL，0. 45 Mm微孔滤膜过滤，超声脱气20 30 min。B 称取 Tris(美国 BBI 公司)0. 122 g，NaClO4 ·Η20(上海生工)42· 12 g，加 Milli-Q 水适量使溶解，用HCl、NaOH调节pH值至7. 4，加MiIli-Q水至1000 mL,0. 45 μ m微孔滤膜过滤，超声脱气20 30 min。1. 4检测条件流 速 1.0 mL/min
梯度时间(min) B (%) A (%) 0199
307525
检测波长260 nm。2、 样品处理
取实施例2和实施例3提纯的核酸约10 μ L置1.5 mL离心管中，加Milli-Q水300 PL溶解，混勻，0.22 μ m有机相针式滤器过滤，设定进样量100 μ L，自动进样分析，记录色谱图。3、数据处理
2.5 min后开始积分，记录主峰面积百分比(Area%)。4、结果分析
如图3 6所示，从乳化物中提纯出的小核酸经高效液相色谱分析，在保留时间约为 17 18 min处显示的峰为小核酸的主峰，纯度在80 99%之间，完整性较好。图3是乳化物061303中提出的小核酸分析图谱，其纯度为83. 7% ；图4是乳化物091101中提纯出的小核酸分析图谱，其纯度为87. 3% ；图5是乳化物091102中提纯出的小核酸分析图谱，其纯度为90. 4% ；图6是乳化物091103中提纯出的小核酸分析图谱，其纯度为90. 9%。需要说明的是，在保留时间约7 min之前的峰为系统引起的干扰峰，如图7所示， 是乳化组合物对照提纯后的高效液相色谱分析图谱，乳化组合物对照是指不含有核酸的乳化组合物，将其按实施例3提纯后进行高效液相色谱分析。
权利要求
1.一种从乳化组合物中提纯核酸的方法，其特征在于，将含核酸的乳化组合物高温加热成乳液状，在其中加入2倍体积的酚氯仿异戊醇试剂，涡旋振荡混勻，经高速离心后取上清液，加入2. 5倍体积的乙醇及沉淀辅助试剂，混合均勻，置低温沉淀，经高速离心后弃上清液，除尽残余乙醇，用无核酸酶的水或缓冲液充分溶解沉淀后进行检测。
2.如权利要求1所述的从乳化组合物中提纯核酸的方法，其特征在于，所述的核酸是 DNA、RNA或核酸类似物。
3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述的RNA是一类具有基因调控功能的非编码RNA。
4.如权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述的非编码RNA包括siRNA和miRNA。
5.如权利要求1所述的从乳化组合物中提纯核酸的方法，其特征在于，所述的乳化组合物是一类化妆品。
6.如权利要求1所述的从乳化组合物中提纯核酸的方法，其特征在于，所述乳化组合物是药用软膏制剂。
7.如权利要求1所述的从乳化组合物中提纯核酸的方法，其特征在于，所述的酚氯仿异戊醇试剂的体积比为25:24:1，ρΗ值为4. 5 8.0。
8.如权利要求1所述的从乳化组合物中提纯核酸的方法，其特征在于，所述的检测包括凝胶电泳检测和高效液相色谱检测。
9.如权利要求1所述的方法在乳化组合物及其类似物核酸提纯中的运用。
全文摘要
本发明涉及一种从乳化组合物中提纯核酸的方法，其特征在于，将含核酸的乳化组合物高温加热成乳液状，在其中加入2倍体积的酚:氯仿:异戊醇试剂，涡旋振荡混匀，经高速离心后取上清液，加入2.5倍体积的乙醇及沉淀辅助试剂，混合均匀，置低温沉淀，经高速离心后弃上清液，除尽残余乙醇，用无核酸酶的水或缓冲液充分溶解沉淀后进行检测。本发明能快速方便地从乳化组合物中提纯出核酸。
文档编号C12N15/10GK102154265SQ201110033830
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月31日 优先权日2011年1月31日
发明者周宋峰, 朱远源, 李铁军 申请人:百奥迈科生物技术有限公司