专利名称：一种复合结构的组织工程化软骨移植物及制备方法
技术领域：
本发明涉及医学和生物医学工程领域，特别涉及到组织工程化软骨移植物及其制备方法。
背景技术：
软骨组织是只含有软骨细胞的单一组织，内部无血管，营养主要依靠组织液的渗透，是具有支撑、保护、分散应力等作用的一种结缔组织。在组织学上可分为透明软骨(关节软骨、肋软骨)、弹性软骨(耳软骨)、纤维软骨(半月板)三大类。在结构上，软骨细胞位于软骨陷窝内，并被周围的软骨囊所包裹。软骨囊就像一道屏障将软骨细胞与周围组织分离开来。所以，软骨组织具有抗原性弱和较轻免疫排斥反应的特性。在临床上，现已证明同种异体软骨细胞可在受体体内存活并分泌基质。
关节软骨的损伤会产生关节区域的疼痛、关节运动障碍等，并且会降低生活的质量和生产力。尤其是，关节软骨的损伤发生后就很难彻底治愈，因为它的自然愈合能力很弱，并且与整个关节损伤发展的程度有关。
现今，应用组织工程学方法修复软骨组织缺损的治疗十分常见。获取软骨细胞，然后将软骨细胞接种到生物降解材料上，构建成细胞-材料复合物，用于软骨组织的缺损修复。
在软骨组织工程领域中，软骨缺损部位的修复效果与单位体积的软骨细胞数量的多少有很大关系。软骨细胞是一种贴附生长的细胞，其本身要求要有载体来承载细胞的增长。并且单纯的软骨细胞植入体内缺损部位后，由于不能固定在缺损部位，会游离到关节液中，无法起到修复治疗的作用。因此，需要有合适的载体，在发挥承载作用的同时对软骨细胞起到固定的作用。
目前应用的软骨细胞载体的三种物理状态1.胶体载体，如胶原、纤维蛋白凝块(FC)等。2.固态载体，常见如胶原纤维网、羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚乙烯二醇(polyethyleneglycol，PEG)、聚乙醇酸(polygiycolic acid，PGA)及它们的共聚物、烧结骨、同种异体脱钙骨或脱矿骨基质、冻干骨、脱蛋白骨、重组合异种骨和珊瑚骨等。
3.复合载体，上述胶体和固体载体的混合物或复合物。
胶体载体与软骨细胞的复合方式为直接将软骨细胞与胶体载体混匀；固态载体与软骨细胞的复合方式为将软骨细胞悬液滴种在固态载体上；或通过负压抽吸而吸附到固态载体中，经过一段时间的培养后细胞可以贴附在载体上。
这几种承载方式有几点不利一、胶体载体从软骨缺损部位脱落，导致手术失败。现今运用胶体载体治疗软骨缺损，多是应用生物蛋白胶将载体粘附在缺损部位，以达到固定作用。但是，软骨缺损多发在关节(如膝关节)等组织液较多的部位，生物蛋白胶极易被稀释或被组织液中的蛋白酶过快降解，使生物胶达不到有效浓度，因而粘度下降，致使载体脱落。二、无论是胶体载体还是固态载体修复软骨缺损时均需要打开关节腔，进行开放式手术，这对患者的损伤较大。
因此，本领域迫切需要开发出损伤小、安全性高、操作性强的组织工程化软骨移植物。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的安全性高的、制法简便、可操作性强组织工程化软骨移植物及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案该复合结构的工程化软骨移植物是由医学上可接受的材料作为固体载体，该固体载体内留有空腔；在该固体载体的空腔内置有医学上可接受的胶体和具有正常功能的软骨细胞均匀地混合而成的混合物。
以上技术方案中所述的医学上可接受的胶体载体可以是生物蛋白胶，其选自海藻酸、纤维蛋白胶(FG)、明胶胶原等天然或人工合成的胶体；软骨细胞是来源于自体、同种异体的软骨细胞以及由其他细胞诱导转化的可用于局部组织修复细胞；固体载体的直径为3-10mm、长度为5-15mm，其内部空腔采用网格结构。
所述的混合物是由含凝血酶浓度为200-600(IU)/ml(较佳的含量为400(IU)/ml)、Ca2+浓度为20-60mmol/L(较佳的浓度为40mmol/L)的溶液与具有正常功能的软骨细胞混合后再与含纤维蛋白原浓度为20-100mg/ml(较佳的含量为50-75mg/ml)、XIII因子浓度为5-75(U)/ml(较佳的含量为10-50(U)/ml)的溶液混合而成；制成后的混合物中软骨细胞的含量不低于0.5×107个/ml。
医学上可接受的生物降解材料是由胶原纤维网、羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚乙烯二醇(polyethyleneglycol，PEG)、聚乙醇酸(polygiycolic acid，PGA)及它们的共聚物、烧结骨、同种异体脱钙骨或脱矿骨基质、冻干骨、脱蛋白骨、重组合异种骨、珊瑚骨磷酸三钙、硫酸钙等天然或人工合成的物质。
所述的软骨细胞和胶体载体的混合物是具有一定结构和强度的，它可以是圆柱形、球形、椭圆形、正方形、长方形、锥形等形状。
所述的医学上可接受的生物降解材料是具有一定形状的，它可以是圆柱形、球形、椭圆形、正方形、长方形、锥形等形状。
所述的组织工程化软骨移植物是上述的软骨细胞和胶体载体的混合物和上述的医学上可接受的生物降解材料的组合体，因此，它的形状是上述的软骨细胞和胶体载体的混合物形状和上述的医学上可接受的生物降解材料形状的组合体。
为了制得组织工程化软骨移植物，本发明提供了一种制备该组织工程化软骨移植物的方法，其步骤如下(1)在无菌环境下，将软骨细胞与含有凝血酶和Ca2+的溶液(已灭菌)混合均匀，制备成溶液4，将溶液4吸入针头注射器中备用。
(2)在无菌环境下，以纤维蛋白原和XIII因子为主要成分制备成溶液5，将溶液5吸入另一针头注射器中，吸入体积与溶液4相等。
(3)在无菌环境下，将直径3-10mm，长度5-15mm的固体载体直立放置，把含有溶液4与溶液5的注射器的针头抵固体载体的顶端后将溶液4、溶液5缓慢打入固体载体。
(4)等待4-8分钟，待溶液4和溶液5混合液凝集成胶体，此时，溶液4和溶液5混合液凝集而成的胶体载体内含有大量的软骨细胞，并被牢牢地固定在固体载体中。
上述步骤(1)中的溶液4液体中软骨细胞浓度不低于1×107个/ml；在与软骨细胞混合前的溶液中凝血酶的含量在200-600(IU)/ml，较佳的含量为400(IU)/ml，Ca2+的浓度为20-60mmol/L较佳的浓度为40mmol/L。
上述步骤(2)中溶液5中的成份包括纤维蛋白原、XIII因子、海藻酸、明胶胶原，其中纤维蛋白原的含量在20-100mg/ml，较佳的含量为50-75mg/ml；XIII因子的含量在5-75(U)/ml，较佳的含量为10-50(U)/ml。
该复合结构的工程化软骨移植物，在体外即完成了纤维蛋白原转化为纤维蛋白单体，并且单体自发聚集成桥键相连的多聚体的胶体过程，使形成的生物蛋白胶体不会被稀释也不受体内各种蛋白酶的干扰，胶体坚固。同时，因为生物蛋白胶凝集过程是在内部连通并具有网格结构的固体载体内部进行，因而胶体与固体载体也结合的相当牢固，胶体不会在一般手术操作的外力下从固体载体内部脱落。在手术过程中，只需关节镜在软骨缺损部位钻孔后，将移植物通过关节镜套管插入即可，操作简便。
概而言之，其优点在于载体在软骨缺损部位结合紧密，不易脱落；软骨细胞均被固定在需修复的相应软骨层，节约了大量的软骨细胞；应用微创外科技术，对患者进行微创手术，减少患者的痛苦，手术操作简单。
图1为本发明复合结构的软骨组织工程移植物结构示意图。
图2为软骨组织工程移植物的制备过程示意图。
具体实施例方式实施例1同种异体脱矿骨的制备、成型1.将同种异体骨的松质骨部分制成直径4mm，长度6mm的圆柱体。
2.将制备好的圆柱体异体骨脱脂肪、蛋白制备去抗原骨用表面活性剂脱脂脱细胞，具体方法参考专利一种用于生物源性人工骨去抗原的制备方法。
3.将圆柱体异体去抗原骨以0.1-2.0mol/L浓度的盐酸，重量比为50∶1的比例进行脱矿，脱矿时间为0.5-3小时。本实施例中盐酸的浓度为0.5mol/L，盐酸与人工骨的重量比为50∶1，脱矿时间为1小时。
4.同种异体骨经过脱细胞、脱脂、脱矿后形成内部连通的网格结构。
5.同种异体骨冻干。
6.圆柱体去抗原异体脱矿骨钴60照射灭菌，备用。
实施例2软骨细胞的获取我们以狗为实验对象。将狗的左后腿膝关节暴露，取其股骨下端的非承重区软骨若干，关节腔缝合。取下的软骨组织以200mg软骨/50ml PBS的比例浸泡于含庆大霉素(40单位/ml)的无菌PBS(浓度0.01mol/L、PH7.4±0.1)中45分钟-60分钟，之后将软骨组织手工切成1mm×1mm×1mm大小的小块；将粉碎的软骨组织块置入0.2％mg/mlII型胶原酶溶液中，置于37℃±0.5℃恒温振荡器内消化8-12小时，过滤，离心；沉淀细胞用无菌PBS(浓度0.01mol/L、PH 7.4±0.1)洗涤两次，台盼蓝染色检测细胞活力，活力＞60％，备用。
实施例3软骨组织工程移植物的制备(以下步骤均要求无菌操作)1.将2.5×105个软骨细胞与25μl含有凝血酶和Ca2+的溶液(已灭菌)混合均匀，制备成溶液4备用。
2.以主要成分为纤维蛋白原和XIII因子的溶液为溶液5，将溶液5吸入另一针头注射器中，吸入体积与溶液4相等。
3.将直径4mm，长度6mm的圆柱形固体载体直立放置，以含有溶液4和溶液5的注射器的针头抵住圆柱形固体载体的顶端后将溶液4、溶液5缓慢打入圆柱形固体载体。
4.静置5分钟，待溶液4和溶液5合液凝集。此时，溶液4和溶液5混合液凝集而成的胶体载体内含有大量的软骨细胞并被牢牢地固定在圆柱形固体载体中。
实施例4软骨组织工程移植物回植动物体内将同一只狗的右后腿关节腔暴露，在其股骨下端的软骨承重区，造成直径为4mm的圆形软骨缺损2个。一个孔作为空白对照，不作任何修复。一个孔用本方法制备成的软骨组织工程移植物修复。分别与4周、12周、27周处死，取材，每组4只狗。
权利要求
1.一种复合结构的组织工程化软骨移植物，其特征在于该复合结构的组织工程化软骨移植物是由医学上可接受的材料作为固体载体(1)，该固体载体内留有空腔；在该固体载体的空腔内有医学上可接受的胶体(2)和具有正常功能的软骨细胞(3)均匀地混合而成的混合物(6)。
2.根据权利要求1所述，其特征在于该混合物(6)是由含凝血酶浓度为200-600(IU)/ml、Ca2+浓度为20-60mmol/L的溶液与具有正常功能的软骨细胞(3)混合后再与含纤维蛋白原浓度为20-100mg/ml、XIII因子浓度为5-75(U)/ml的溶液混合而成。
3.根据权利要求1或2所述，其特征在于该混合物(6)中软骨细胞(3)的含量不低于0.5×107个/ml。
4.根据权利要求3所述，其特征在于该胶体(2)由生物蛋白胶制成的胶体。
5.根据权利要求3所述，其特征在于该固体载体(1)由医学上可接受的生物降解材料制成，其直径为3-10mm，长度为5-15mm。
6.根据权利要求3所述，其特征在于该固体载体(1)的内部空腔采用网格结构。
7.一种制造权利要求1所述的复合结构的工程化软骨移植物的制备方法，其步骤如下(1)在无菌环境下，将软骨细胞与含有凝血酶和Ca2+的溶液(已灭菌)混合均匀，制备成溶液(4)，将溶液(4)吸入针头注射器中备用。(2)在无菌环境下，以纤维蛋白原和XIII因子为主要成分制备成溶液(5)，将溶液(5)吸入另一针头注射器中，吸入体积与溶液(4)相等。(3)在无菌环境下，将直径3-10mm，长度5-15mm的固体载体直立放置，把含有溶液(4)与溶液(5)的注射器的针头抵住固体载体的顶端后将溶液(4)、溶液(5)缓慢打入固体载体。(4)等待4-8分钟，待溶液(4)和溶液(5)混合液凝集成胶体，此时，溶液(4)和溶液(5)混合液凝集而成的胶体载体内含有大量的软骨细胞，并被牢牢地固定在固体载体中。
8.根据权利要求7所述，其特征在于该步骤(1)中在与软骨细胞混合前的溶液中凝血酶的含量在200-600(IU)/ml，较佳的含量为400(IU)/ml；Ca2+的浓度为20-60mmol/L，较佳的浓度为40mmol/L。
9.根据权利要求7或8所述，其特征在于该步骤(2)中溶液(5)的主要成分是纤维蛋白原和XIII因子，溶液(5)中纤维蛋白原的含量在20-100mg/ml，较佳的含量为50-75mg/ml；XIII因子的含量在5-75(U)/ml，较佳的含量为10-50(U)/ml。
10.根据权利要求7所述，其特征在于该步骤(1)中的软骨细胞是来源于自体、同种异体的软骨细胞以及由其他细胞诱导转化的可用于局部组织修复细胞，在溶液(5)中软骨细胞浓度不低于1×107个/ml。
全文摘要
本发明公开了一种复合结构的组织工程化软骨移植物及制备方法，由医学上可接受的材料作为固体载体(1)，该固体载体内留有空腔；在该固体载体的空腔内有医学上可接受的胶体(2)和具有正常功能的软骨细胞(3)均匀地混合而成的混合物(6)。其制备方法为将软骨细胞和胶体载体的混合物与医学上可接受的生物降解材料复合，形成移植物。本发明复合结构的组织工程化软骨移植物可有效治疗软骨缺损和体表凹陷性缺损，并具有损伤小、安全性高、操作性强的优点。
文档编号A61L27/36GK1785441SQ20051013470
公开日2006年6月14日 申请日期2005年12月19日 优先权日2005年12月19日
发明者孙磊, 田伟, 陈磊, 江健, 陶剑峰 申请人:北京市创伤骨科研究所