专利名称：抑制多效生长因子基因表达的小干扰rna及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及小干扰RNA及其应用，特别是涉及抑制多效生长因子(Pleiotrophin)基因表达的小干扰RNA及其作为肿瘤治疗药物的应用。
背景技术：
多效生长因子(Pleiotrophin，Ptn)是1989年从围产期鼠脑组织中纯化而来的，研究表明Ptn也存在于一些非神经组织中，如子宫、心脏、软骨等。它能够促进轴突生长，刺激细胞的增殖与迁移，促进血管生成，促进神经系统及骨的发育等。Ptn蛋白具有2个β-sheet(β-折叠)结构域，通过易折叠的linker相连，每个β-折叠结构域又含有3个呈反平行的β-链，N端和C端富含赖氨酸，形成袖口样形状。最近的研究表明肺癌、结肠癌、胃癌等肿瘤患者血清中Ptn的水平明显高于正常对照，尤其在肿瘤的早期阶段更为显著。Ptn在其信号传导通路中有四个受体，分别为N-syndecan、PTPξ、ALK和LRP。Ptn与N-syndecan结合，可以促进轴突生长；与PTPξ结合，可以使磷酸化的PTPξ失活，最终导致β-catenin酪氨酸磷酸化；与ALK结合，可以促进细胞的锚着独立性生长能力；LRP是一种膜蛋白，Ptn与其结合，可以抗凋亡。
肿瘤抑制基因PTEN在多种进展期肿瘤组织中，如脑肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、膀胱癌、甲状腺癌等都存在着不同程度的突变或丢失，它是人类肿瘤中突变率最高的基因之一。PTEN基因位于染色体10q23.3，作为脂质磷酸酶，PTEN下调PI3K/AKT通路，调控细胞周期进展和细胞凋亡；作为蛋白磷酸酶，PTEN具有抑制MAPK信号通路的作用。
本发明的发明人通过基因芯片杂交发现正常小鼠胚胎成纤维细胞系和PTEN缺失的胚胎成纤维细胞系之间的基因表达存在差异，Northern杂交证实在PTEN缺失的胚胎成纤维细胞系中Ptn高表达，并发现在血小板衍生生长因子(PDGF)的刺激下，Ptn的表达增强。用LY294002抑制PI3K后，Ptn的表达明显下降，并且PTEN缺失后，Akt的高表达可导致Ptn的表达增强。
上述研究表明抑制Ptn的表达水平可能会对Pten缺失的肿瘤起到抑制作用，提示Ptn可作为治疗具有Pten基因突变的肿瘤的药物靶标。近年发展起来的RNA干涉技术为成功抑制Ptn基因的表达提供了一种便捷、有效的手段。
RNA干扰(RNA interference，简称RNAi)是通过小分子双链RNA(ds RNA)特异性互补结合靶向基因转录本，从而导致基因转录后沉默的一种技术。具有基因沉默作用的小分子双链RNA的长度通常为21-23nt，又被称为小干扰RNA(siRNA，smallinterfering RNA)，这些小片段会进一步介导与其同源的单链RNA降解。siRNA结构稳定，无须像反义核苷酸那样进行广泛的化学修饰以提高其半衰期，并能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下，使靶基因降低至极低水平甚至完全“敲除”。siRNA的干预效应关键取决于其靶基因序列的选择，任一nt的错误均会导致RNAi效应的丧失，这种高度序列特异性使其具有重要的药理学价值。已证实，RNA干扰技术可单独或与其它现有的治疗手段一同用于某些疾病的治疗，如病毒感染，肿瘤等。
发明内容
本发明的目的是提供一对能有效抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA。
本发明所提供的抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA，是正义链为序列表中的SEQ ID №1，反义链为序列表中的SEQ ID №2的双链RNA序列。
将上述双链RNA序列命名为Ptn siRNA，其反义链与Ptn mRNA的243-261位置序列互补。序列表中SEQ ID №1由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中SEQ ID №2由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。
编码上述抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA的序列也属于本发明的保护范围。它具有下述双链核苷酸序列正义链(不做模板的DNA链)具有序列表SEQ ID№3的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中SEQ ID №4的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID №3由64个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中SEQ ID №4由64个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。
含有抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA编码序列的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA编码序列中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种抑制多效生长因子基因表达的方法。
本发明所提供的抑制多效生长因子基因表达的方法，是将上述含有抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA编码序列的载体导入宿主中，多效生长因子基因的表达得到抑制。
所述抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA的编码序列可通过含有所述抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA的编码序列的siRNA干扰载体导入宿主；用于构建所述siRNA干扰载体的出发载体可为任意一种可在宿主中表达外源siRNA的载体，如pSilencerTM3.1-H1(购自美国Ambion公司，物理图谱如
图1所示)。
以pSilencerTM3.1-H1为出发载体，构建的siRNA表达载体为pPtn-siRNA B。
本发明提供了一对抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA。实验证明，本发明的小干扰RNA对Ptn基因具有显著的抑制作用，此外，通过沉默Ptn基因，可以抑制PTEN基因缺失细胞的增殖，表明Ptn可以作为治疗具有PTEN基因突变的肿瘤的药物靶标。因此可以以抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA的编码序列作为活性成分制备成肿瘤治疗性药物。本发明在医学和生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
说明书附1为载体pSilencerTM3.1-H1的物理图谱图2为Northern印迹检测不同siRNA对Ptn基因表达抑制能力的结果图3为Northern印迹筛选Ptn被稳定沉默的Pten-/-MEF241细胞克隆的结果图4为抑制Ptn基因的表达对Pten-/-MEF241细胞生长影响的检测结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物由美国应用生物系统的DNA自动合成仪合成。
实施例1、抑制多效生长因子基因表达的siRNA干扰载体的构建根据多效生长因子基因的mRNA序列设计其siRNA序列，得到三条双链RNA序列，分别命名为Ptn-siRNA A、Ptn-siRNA B、Ptn-siRNA C，序列如下Ptn-siRNA A正义链5’-aaagucugacuguggagaaug-3’反义链5’-cauucuccacagucagacuuu-3’；Ptn-siRNA B正义链5’-aagacucagagauguaagauc-3’(序列表中SEQ ID №1)反义链5’-gaucuuacaucucugagucuu-3’(序列表中SEQ ID №2)；Ptn-siRNA C正义链5’-aaugugaccucaauaccgccu-3’反义链5’-aggcgguauugaggucacauu-3’。
再根据上述三条Ptn siRNA序列合成构建抑制多效生长因子基因表达的siRNA
干扰载体所需的DNA序列，序列如下Ptn-siRNA A的编码序列Ptn-siDNA A1(正义链)5’-gatcccagtctgactgtggagaatgttcaagagacattctccacagtcagactttttttggaaa-3’Ptn-siDNA A2(反义链)5’-ggtcagactgacacctcttacaagttctctgtaagaggtgtcagtctgaaaaaaaccttttcga-3’；Ptn-siRNA B的编码序列Ptn-siDNA B1(正义链)5’-gatcccgactcagagatgtaagatcttcaagagagatcttacatctctgagtcttttttggaaa-3’(序列表中SEQ ID №3)Ptn-s iDNA B2(反义链)5’-ggctgagtctctacattctagaagttctctctagaatgtagagactcagaaaaaaccttttcga-3’(序列表中SEQ ID №4)；Ptn-siRNA C的编码序列Ptn-siDNA C1(正义链)5’-gatcccctgtgacctcaataccgcctttcaagagaaggcggtattgaggtcacattttttggaaa-3’Ptn-siDNA C2(反义链)5’-ggcacactggagttatggcggaaagttctcttccgccataactccagtgtaaaaaaccttttcga-3’。
以pSilencerTM3.1-H1(pSilencer hygroTM试剂盒提供，购自美国Ambion公司)为出发载体，构建抑制多效生长因子基因表达的siRNA干扰载体，具体方法为用水将合成好的六条发夹状寡核苷酸序列溶解并稀释至浓度为1μg/μl；将六条序列分成三对(Ptn-siDNA B1和Ptn-siDNA B2、Ptn-siDNA A1和Ptn-siDNA A2、Ptn-siDNAC1和Ptn-siDNA C2)，先将Ptn-siDNA B1和Ptn-siDNA B2各吸取2μl，并加入1×DNAAnnealing Solution 46μl配制成总体积为50μl的退火反应体系，混匀后90℃3min，37℃孵育1h。再从退火后的混合液中吸取1μl，并加入10×T4DNA连接酶缓冲液1μl、pSilencerTM3.1-H1 1μl、T4 DNA连接酶0.5μl、水6.5μl，配制成总体积为10μl的连接反应体系，16℃连接12-24小时。用常规方法将连接产物及siRNA表达载体试剂盒pSilencer hygroTM中所提供的阴性对照质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中，涂板并挑取阳性克隆进行序列测定，将正确插入siRNA的克隆大量扩增后，用QIAprep@Spin Miniprep质粒提取试剂盒(QIAGEN公司)并参照试剂盒说明书提取质粒，由此得到抑制多效生长因子基因表达的siRNA干扰质粒，命名为pPtn-siRNA B，用同样方法得到分别含有Ptn-siRNA A编码序列和Ptn-siRNA C编码序列的siRNA干扰质粒，并分别命名为pPtn-siRNA A和pPtn-siRNA C。
实施例2、检测不同siRNA对Ptn基因表达的抑制能力将实施例1构建的三种多效生长因子基因表达的siRNA干扰载体分别瞬时转染至3T3细胞，阴性对照siRNA质粒购自Ambion公司，转染24小时后，用NorthernBlotting的方法杂交检测三种siRNA在RNA水平上对Ptn基因的抑制效果，具体方法为分别提取瞬时表达pPtn-siRNA A、pPtn-siRNA B和pPtn-siRNA C细胞的总RNA，以Prime-a-Gene标记试剂盒(Promega)标记α-32P dCTP于Ptn基因的cDNA片段作为探针(探针序列为序列表中SEQ ID №5)，检测结果如图2所示(18S、28S rRNA为加样量控制，加样量控制采用甲醛变性胶RNA电泳的照片)，表明Ptn-siRNA B和Ptn-siRNA C具有较好的抑制Ptn RNA水平的能力。
实施例3、稳定表达Ptn siRNA细胞株的获得及其检测通过脂质体法将实施例1获得的抑制多效生长因子基因表达的siRNA干扰质粒pPtn-siRNA B和pPtn-siRNA C分别转染Pten-/-MEF241细胞(肿瘤抑制基因Pten缺失的小鼠胚胎成纤维细胞，Freeman et al.Cancer Cell.2003 Feb；3(2)117-30)，阴性对照质粒与实施例2相同，Pten-/-MEF241细胞为永生化Ptenloxp.loxp小鼠胚胎成纤维细胞经体外条件敲除Pten基因后得到的细胞克隆，然后再将两种转染细胞分别接种裸鼠，并从成瘤裸鼠肿瘤中分离得到的单克隆细胞。将单克隆细胞用含有10％胎牛血清的DMEM培养基(DMEM培养基购自Gibco公司、胎牛血清购自Hyclone公司)常规培养，转染24h后，加入浓度为180μg/mL的潮霉素进行筛选，细胞常规培养，每三天换液一次，换液时加入新鲜潮霉素，两周后，稳定转染Ptn siRNA的细胞在60mm培养皿中逐渐长满，胰酶消化并传至25cm2培养瓶中继续培养，加入浓度减半为90μg/mL的潮霉素以维持细胞生长。当稳定转染Ptn siRNA的细胞在培养瓶中连续传代培养5代后，将此细胞以极低密度接种的方法接种于60mm培养皿中使之为单细胞生长，当单细胞分裂成上千个细胞而成为克隆时，挑选生长状态良好的单克隆，用去头的枪尖挑取这些单克隆分别培养，最终得到稳定表达Ptn-siRNA B、Ptn-siRNA C的细胞克隆株。
接着对稳定表达Ptn-siRNA B、Ptn-siRNA C的细胞克隆株用Northern印迹的方法检测Ptn基因的表达情况，所用探针与实施例2相同，结果如图3所示(转染阴性对照siRNA的选取1个克隆，转染Ptn-siRNA B的选取3个克隆，转染Ptn-siRNAC的选取2个克隆；18S、28S rRNA为加样量控制，加样量控制采用甲醛变性胶RNA电泳的照片)，Ptn基因的表达在稳定转染Ptn-siRNA B的3个克隆中都被显著抑制，而转染Ptn-siRNA C的两个细胞株的抑制效果相对要差。选取稳定转染Ptn-siRNA B的2号克隆及转染Ptn-siRNA C的2号克隆作进一步分析。
实施例4、利用细胞生长曲线检测沉默Ptn基因对Pten-/-MEF241细胞生长的影响对稳定转染Ptn-siRNA B的2号克隆，转染Ptn-siRNA C的2号克隆以及转染阴性对照siRNA的克隆的细胞生长曲线进行重复检测，以检测沉默Ptn基因对Pten-/-MEF241细胞生长的影响。具体实验方法为实验分3组Pten-/-MEF241/阴性对照组，Pten-/-MEF241/Ptn-siRNA B2号克隆细胞组，Pten-/-MEF241/Ptn-siRNA C2号克隆细胞组，每组设3个复孔，每孔接种8×103个细胞(24孔板)，按常规方法培养。自接种后第2天起，每天同一时间消化每组细胞3孔，精确计数，连续7d，然后绘制各组细胞的生长曲线，生长曲线重复测定3次，统计学分析采用方差分析，用GraphPad Prism4软件包完成，生长曲线如图4所示(结果为3次独立实验的典型代表，*表示同对照组相比P值小于0.001，**表示同对照组相比P值小于0.0001)，结果稳定转染Ptn-siRNA B及Ptn-siRNA C的Pten-/-MEF241细胞的增殖能力均落后于对照细胞，尤其是稳定转染Ptn-siRNA B的细胞增殖能力显著低于对照细胞，在指数期第3-4天，稳定转染Ptn-siRNA B的2号克隆的细胞密度仅为对照细胞密度的四分之一，细胞增殖明显减慢，表明Ptn-siRNA B对Pten-/-MEF241细胞的增殖能力具有较强的抑制作用。
实施例5、裸鼠成瘤实验将实施例3获得的稳定表达Ptn-siRNA B的2号克隆细胞株接种裸鼠进行裸鼠成瘤实验，以观察Ptn基因沉默后Pten-/-MEF241细胞的致瘤特性是否改变，具体方法为裸鼠被分为2组，每组8只动物实验组接种稳定表达Ptn-siRNA B的2号克隆细胞株；对照组为接种稳定转染阴性对照质粒的Pten-/-MEF241细胞；每只裸鼠接种细胞量约为2-3×106个细胞，接种部位为右肩胛后皮下。细胞接种后每周观察一次，致瘤性检测结果如表1所示，稳定表达Ptn-siRNA B的2号克隆细胞株的成瘤率显著降低，而且肿瘤的潜伏时间也得到很大程度地延长，表明抑制Ptn基因的表达水平，会对Pten缺失的具有恶性表型的细胞的增殖及致瘤性起到抑制作用，提示Ptn基因可作为治疗具有PTEN基因突变的肿瘤的药物靶标。
表1 Ptn表达水平被siRNA抑制后Pten-/-MEF241细胞的致瘤性检测结果
注*表示接种2个月后秤重 **表示接种4个月10天后秤重。
序列表<160>5<210>1<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1aagacucaga gauguaagau c 21<210>2<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gaucuuacau cucugagucu u 21<210>3<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gatcccgact cagagatgta agatcttcaa gagagatctt acatctctga gtcttttttg60gaaa 64<210>4<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4ggctgagtct ctacattcta gaagttctct ctagaatgta gagactcaga aaaaaccttt60tcga 64<210>5<211>507<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5atgtcgtccc agcaatatca gcagcaacgt agaaaatttg cagctgcctt cctggcattg 60attttcatct tggcagctgt ggacactgct gaggccggga agaaagagaa acctgaaaaa120aaggtgaaaa agtctgactg tggagaatgg cagtggagtg tgtgtgtgcc taccagcggg180gactgtggat tgggcacccg ggagggcact cgcactggcg ccgagtgcaa acagaccatg240aagactcaga gatgtaagat cccttgcaac tggaagaagc agtttggagc tgagtgcaag300
taccagttcc aggcttgggg agaatgtgac ctcaataccg ccttgaagac cagaactggc 360agcctgaagc gagctctgca caatgctgac tgtcagaaaa ctgtcaccat ctccaagccc 420tgtggcaagc tcaccaagcc caagcctcaa gcggagtcaa agaagaagaa aaaggaaggc 480aagaaacagg agaagatgct ggattaa 50权利要求
1.抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA，是正义链为序列表中的SEQ ID №1，反义链为序列表中SEQ ID №2的双链RNA序列。
2.权利要求1所述的抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA的编码序列。
3.根据权利要求2所述的编码序列，其特征在于所述抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA的编码序列是下述双链核苷酸序列正义链具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID №4的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述编码序列的表达载体。
5.含有权利要求4所述表达载体的转基因细胞系。
6.含有权利要求4所述表达载体的宿主菌。
7.一种抑制多效生长因子基因表达的方法，是将权利要求2所述的抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA的编码序列导入宿主中，多效生长因子基因得到抑制。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA的编码序列通过含有所述抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA编码序列的siRNA干扰载体导入宿主；用于构建所述siRNA干扰载体的出发载体为pSilencerTM 3.1-H1。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述含有抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA编码基因的sRNAi干扰载体为pPtn-siRNA B。
10.权利要求1所述的抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA作为肿瘤治疗药物的应用。
全文摘要
本发明公开了抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA及其应用，其目的是提供抑制多效生长因子基因表达的小干扰RNA与其作为肿瘤治疗性药物的应用。该小干扰RNA是正义链为序列表中的SEQ ID №1，反义链为序列表中SEQ ID №2的双链RNA序列。其编码序列是下述双链核苷酸序列正义链具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID №4的核苷酸序列。本发明在医学和生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
文档编号A61P35/00GK1800387SQ20051013467
公开日2006年7月12日 申请日期2005年12月19日 优先权日2005年12月19日
发明者李刚, 胡迎春, 霍艳英, 吴德昌 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所