至7.30?7.50 ;把新鲜同种异体骨软骨移植物经磷酸盐缓冲液清洗3-5次；将骨软骨块在4°C下经梯度玻璃化溶液:1/3浓度玻璃化保护液、2/3浓度玻璃化保护液、3/3玻璃化保护液等逐级依次浸泡10分钟，用冷藏管封装，做好标记，然后直接以最快速度投入液氮中保存。在第8周将软骨块复温:冷冻骨软骨块取出后，立即行37°C水浴复温10秒，然后依次投入37°C 10%、5%蔗糖溶液中各停留5分钟，最后磷酸盐缓冲液液冲洗3遍。然后用荧光标记法测定细胞存活率为65%。
[0030]实施例2:每100ml玻璃化保护液包括:99.9%二甲基亚砜205ml、乙酰胺155g、
1.2-丙二醇100ml、聚乙二醇(8000)60g、海藻糖60g、余为去离子水，将原料配制成溶液，搅拌均匀，调节PH值至7.30?7.50 ;把新鲜同种异体骨软骨移植物经磷酸盐缓冲液清洗3-5次；将骨软骨块在4°C下经梯度玻璃化溶液:1/3浓度玻璃化保护液、2/3浓度玻璃化保护液、3/3玻璃化保护液逐级依次浸泡10分钟，用冷藏管封装，做好标记，然后直接以最快速度投入液氮中保存。在第8周将软骨块复温:冷冻骨软骨块取出后，立即行37°C水浴复温10秒，然后依次投入37°C 10%、5%蔗糖溶液中各停留5分钟，最后磷酸盐缓冲液液冲洗3遍。然后用荧光标记法测定细胞存活率为68%。
[0031]实施例3:每100ml玻璃化保护液包括:99.9%二甲基亚砜225ml、乙酰胺190g、
1.2-丙二醇115ml、聚乙二醇(8000)70g、海藻糖90g、余为去离子水，将原料配制成溶液，搅拌均匀，调节PH值至7.30?7.50 ;把新鲜同种异体骨软骨移植物经磷酸盐缓冲液清洗3-5次；将骨软骨块在4°C下经梯度玻璃化溶液:1/3浓度玻璃化保护液、2/3浓度玻璃化保护液、3/3玻璃化保护液等逐级依次浸泡10分钟，用冷藏管封装，做好标记，然后直接以最快速度投入液氮中保存。在第8周将软骨块复温:冷冻骨软骨块取出后，立即行37°C水浴复温10秒，然后依次投入37°C 10%、5%蔗糖溶液中各停留5分钟，最后磷酸盐缓冲液液冲洗3遍。然后用荧光标记法测定细胞存活率为66%。
[0032]本发明保护液成分选用二甲基亚砜、乙酰胺、丙二醇等为渗透性保护剂成分，海藻糖、聚乙二醇等为非渗透性保护玻璃化保护剂成分。本发明较对照组保护液相比，添加了海藻糖溶液，提高了软骨长时间按保存后的存活率，具体机制为:二甲基亚砜在大量实验中被证明具有易玻璃化和高渗透性等特点，但高浓度的二甲基亚砜对细胞的毒性和渗透损伤很高。乙酰胺是一种较小分子量和较高渗透性的保护剂，并且具有毒性中和能力，在植物材料和动物材料的玻璃化冻存中被广泛使用。聚乙二醇的毒性较小，但玻璃化形成能力差。在玻璃化溶液中加入非渗透性保护剂，提高了细胞外液的渗透压，同样也降低细胞玻璃化所需的渗透性保护剂的浓度，这样生物材料既形成玻璃化，又降低了渗透性保护剂对细胞的毒性。海藻糖和二甲基亚砜合用能够产生协同效应，促进玻璃化进程，减少冰晶的产生，减轻组织再损伤，延长保存时间，如图2示为本发明玻璃化冷冻保护液各个阶段细胞存活率，可以看出经本发明软骨玻璃化冷冻保护液保存后的软骨的存活率高于对照组，并具有统计学意义。
[0033]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及软骨保存方法，其特征在于:该保存液每100ml包含:99.9%二甲基亚砜150?250ml、乙酰胺110?200g、1，2-丙二醇70?120ml、聚乙二醇10?80g、海藻糖20?100g，余为去离子水。2.如权利要求1所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液，其特征在于，该软骨玻璃化保护液的PH值为7.30?7.50 ;处理后软骨块封装后在液氮中保存。3.如权利要求1所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液，其特征在于，该软骨玻璃化保护液每100ml骨软骨移植物保护液含99.9% 二甲基亚砜160ml、乙酰胺125g、l，2_丙二醇80ml、聚乙二醇30g、海藻糖40g、余为去离子水。4.如权利要求1所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液，其特征在于，该软骨玻璃化保护液每100ml软骨玻璃化保护液含99.9%二甲基亚砜205ml、乙酰胺155g、l，2_丙二醇100ml、聚乙二醇60g、海藻糖60g、余为去离子水。5.如权利要求1所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液，其特征在于，该软骨玻璃化保护液每100ml含99.9%二甲基亚砜225ml、乙酰胺190g、l，2-丙二醇115ml、聚乙二醇70g、海藻糖90g、余为去离子水。6.一种如权利要求1所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液，其特征在于，应用该保护液对关节软骨进行保存方法包括如下步骤: 步骤一，取99.9%二甲基亚砜、乙酰胺、1，2-丙二醇、聚乙二醇、海藻糖、余为去离子水，配制成溶液，搅拌均匀，通过加酸或碱调节PH值至7.30?7.50 ; 步骤二，把新鲜同种异体骨软骨移植物经磷酸盐缓冲液清洗3-5次； 步骤三，将步骤二骨软骨移植物将骨软骨块在4°C下经梯度玻璃化冷冻保护溶液处理，即依次经过1/3浓度玻璃化保护液、2/3浓度玻璃化保护液、3/3浓度的护液逐级依次浸泡10分钟，用冷藏管封装，做好标记，然后直接以最快速度投入液氮中保存； 步骤四，骨软骨移植物使用时，将骨软骨块取出进行复温:37°C水浴复温10秒，然后依次投入37°C 10%、5%蔗糖溶液中各停留5分钟，最后磷酸盐缓冲液液冲洗3遍。7.一种如权利要求1-6任意一项所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液及其软骨保存方法，应用于骨软骨组织长期保存、软骨组织库建立以及临床同种异体骨软骨移植修复关节软骨缺损。
【专利摘要】本发明公开了一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及软骨保存方法，每1000ml玻璃化冷冻保护液包含：99.9％二甲基亚砜150～250ml、乙酰胺110～200g、1,2-丙二醇70～120ml、聚乙二醇10～80g、海藻糖20～100g、余为去离子水。将骨软骨块在4℃下依次经梯度的玻璃化冷冻保护溶液依次浸泡10分钟，用冷藏管封装，投入液氮中保存；在移植前取出进行复温，37℃水浴复温10秒，然后依次投入37℃10％、5％蔗糖溶液中各停留5分钟，最后磷酸盐缓冲液液冲洗3遍即可移植应用。本发明使关节软骨组织长期保存，维持软骨较高细胞存活率，提高骨软骨移植物保存效果，用于软骨组织库及临床软骨移植。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN104938478
【申请号】CN201510257292
【发明人】亓建洪, 谢地, 李 昊, 宋洪强, 陈彬, 董军
【申请人】泰山医学院
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年5月20日