一种cik细胞冻存液及冻存方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞冻存技术领域，特别涉及一种新型CIK细胞冻存液及冻存方法。 本发明通过添加人自体血浆，避免了外源血清存在的传染病的风险，所采用的试剂适用于 程序降温盒这种简单的程序降温方法。本发明具有方法简单，细胞复苏活性高的特点。
【背景技术】
[0002] CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种 新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞 同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞（自然杀伤细胞）样T淋巴细胞， 兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细 胞的识别能力很强，如同"细胞导弹"，能精确"点射"肿瘤细胞，但不会伤及"无辜"的正常 细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩 散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首 选方案。
[0003] 在生物学技术飞速发展的当今，人们在细胞生物学及其相关学科的研宄中，越来 越多的运用细胞培养增殖技术，将有研宄意义或有应用前景的细胞采用低温度进行长期保 存数年，数十年甚至百年，一旦需要，可随时对所保存的细胞进行复苏，恢复其完整的形态 结构与生物学特性，供生命科学研宄实验。
[0004] CIK细胞具有强大的杀瘤活性，具有TIL、LAK细胞无法比拟的优势，但诱导CIK细 胞需要花费很长的时间，在临床应用上需要多次诱导和采血，给患者造成了极大的痛苦和 不必要的麻烦。也有人提出将对数期生长的CIK细胞像其他传代细胞一样低温保存，需要 时再复苏。但是现有的技术使得复苏的细胞活性偏低，达不到我们高效增值的目的。
[0005] 目前现有的技术不足：现有的冻存液包括含血清冻存液与不含血清冻存液两种。 血清富含CIK细胞生长所需的多种细胞因子及营养物质，是其他培养基所不能比拟的。所 以不含血清的冻存液使得冻存的细胞复苏后活性降低，根本达不到我们高效增值的目的。 而使用血清又存在着自体血清很难获取，外源血清有传染病的风险。而且，现有冻存程序复 杂，不利于实际操作的进行。
[0006] 本发明首次提出使用人自体血浆替代血清，与培养基、二甲基亚砜以4:5:1比例 配比，制成CIK细胞冻存液，然后采用程序降温盒这种简单的程序降温办法完成冻存。人自 体血浆与血清成分相似，亦含有CIK细胞生长所需的各种细胞因子及营养物质，而且属于 CIK细胞分离的副产物，方便获取，又不存在异源性，所以本发明将成为CIK细胞冻存的首 选方案。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供一种CIK细胞的冻存液及冻存方法。
[0008] 本发明中一些常用的术语说明如下： PBMC:外周血单个核细胞； IL-2 :白细胞介素2 ; IL-1 a :白细胞介素1 a ; IFN-y :干扰素y ; CD3mAb:细胞表面分子3单克隆抗体； CD28mAb:细胞表面分子28单克隆抗体； DMSO:二甲基亚砜。
[0009] 本发明的技术方案如下： 一种CIK细胞冻存液及冻存方法，其特征在于如下步骤： (1)将人自体血浆置于无菌离心管中，1800rpm离心6分钟。
[0010] (2)吸取上层血浆，转移至新的离心管中，3000rpm离心20分钟，吸取上清，即为冻 存用人自体血浆。
[0011] (3)将二甲基亚砜、上述人自体血浆、培养基X-VIV015按体积比1:4:5混匀即为 CIK细胞冻存液。
[0012] (4)取培养至第7天的CIK细胞，1800rpm离心6分钟，弃上清，加入上述CIK细胞 冻存液，调整细胞浓度为1*1〇 8个/mL，取5mL加入5mL无菌冻存管中。将冻存管放入在4 度冰箱预冷的程序降温盒中。
[0013] (5)将放有冻存管的程序降温盒置于-80度冰箱中24小时后，再放于液氮中长期 保存。
[0014] 其中，步骤（4)提到的培养至第7天的CIK细胞获取方法包括如下步骤： ① 从外周血中分离外周血单个核细胞，重悬于X-VIV015无血清培养基中，使外周血单 个核细胞的细胞浓度为1 X 106个/mL，静置培养3天； ② 向步骤①制得的培养液中补加X-VIV015无血清培养基至100mL，同时添加IL-2,使 IL-2的浓度为1 X 103U/mL，静置培养1天； ③ 向步骤②制得的培养液中补加X-VIV015无血清培养基至200-240mL，同时添加 IL-2,使IL-2的浓度为IX 103U/mL，静置培养3天；制得处于对数生长期的种子CIK细胞。
[0015] 其中，所述X-VIV015无血清培养基添加了以下组分：rhIFN-y 1000U/mL、胸腺法 新 500ng/mL、rhlL-la 100U/mL、CD3mAb 100ng/mL、CD28mAb 100ng/mL。
[0016] 其中，所述静置培养条件为在温度为37°C、C02体积百分比为含量为7. 5%、相对饱 和湿度为1〇〇 %的〇)2培养箱中培养。
[0017] 本发明的方法是经过筛选的，筛选过程如下： (1)二甲基亚砜：人自体血浆：培养基=1:2:7 ; ⑵二甲基亚砜：人自体血浆：培养基=1:3:6 ; (3) 二甲基亚砜：人自体血浆：培养基=1:4:5 ; (4) 二甲基亚砜：人自体血浆：培养基=1:5:4。
[0018] 为此，本发明提出了以下四种筛选条件。
[0019] 实验条件1: (1)将人自体血浆置于无菌离心管中，1800rpm离心6分钟。
[0020] (2)吸取上层血浆，转移至新的离心管中，3000rpm离心20分钟，吸取上清，即为冻 存用人自体血浆。
[0021] (3)将二甲基亚砜、上述人自体血浆、培养基X-VIV015按体积比1:2:7混匀即为 CIK细胞冻存液。
[0022] (4)取培养至第7天的CIK细胞，1800rpm离心6分钟，弃上清，加入上述CIK细胞 冻存液，调整细胞浓度为1*1〇 8个/mL，取5mL加入5mL无菌冻存管中。将冻存管放入在4 度冰箱预冷的程序降温盒中。
[0023] (5)将放有冻存管的程序降温盒置于-80度冰箱中24小时后，将冻存管放于液氮 中长期保存。
[0024] (6)从液氮中取出冻存的CIK细胞，常规方法，置37°C水浴2min左右速溶，用台盼 蓝法检测复苏细胞活性，计算复苏细胞活率。
[0025] 对比实验条件1 : (1)将人自体血浆置于无菌离心管中，1800rpm离心6分钟。
[0026] (2)吸取上层血浆，转移至新的离心管中，3000rpm离心20分钟，吸取上清，即为冻 存用人自体血浆。
[0027] (3)将二甲基亚砜、上述人自体血浆、培养基X-VIV015按体积比1:2:7混匀即为 CIK细胞冻存液。
[0028] (4)取培养至第7天的CIK细胞，1800rpm离心6分钟，弃上清，加入上述CIK细胞 冻存液，调整细胞浓度为1*1〇 8个/mL，取5mL加入5mL无菌冻存管中。按照温度下降速度 为10摄氏度/小时的速率将冻存管置-20°C，2小时，置-40°C，2小时，置-80°C，2小时，然 后浸入液态氮中长期保存。
[0029] (5)从液氮中取出冻存的CIK细胞，常规方法，置37°C水浴2min左右速溶，用台盼 蓝法检测复苏细胞活性，计算复苏细胞活率。
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