一种在大肠杆菌中一步法合成dna片段并组装合成基因的方法
【专利摘要】本发明提出了一种在大肠杆菌中一步法合成DNA片段并组装合成基因的方法，主要步骤包括：构建LIC载体质粒LIC-A；制备LIC-A线性载体；构建组装DNA片段的受体载体puc-Kana；选择目标基因，划分300bp左右的小片段进行合成；多个小片段DNA利用金门克隆反应组装成大片段基因。本发明操作简单，无需再重复做克隆和测序的操作，直接退火，克隆效率高，使用了发光报告基因sfgfp、gfp，筛选方法直观，合成方法的错误率很低，合成基因的周期短，大大节约了成本，节约了时间。本发明适用于各种基因的合成，对于大基因的合成特别有效。
【专利说明】一种在大肠杆菌中一步法合成DNA片段并组装合成基因的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基因合成方法的研究，是一种在大肠杆菌中一步法合成DNA片段并组装合成基因的方法，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]合成生物学是生命科学在二十一世纪刚刚出现的一个分支学科，近年来合成生物学的研究进展很快，特别是基因合成技术。全基因合成是依照某一蛋白质的基因序列，设计合成相互重叠的单链寡核苷酸，再通过重叠延伸PCR法拼接出全长，基因合成无需模板，是获取基因的手段之一。通过全基因合成实现基因的分子改造和人工组建正成为一种实验室常规手段。因此，建立一种能够在相对低廉和短时间内准确和高效地设计和合成长片段基因的方法十分重要。
[0003]随着合成生物学的研究越来越流行，人们对生命的探究不再仅仅局限在宏观生物上，而是从更简单的基本单元基因着手，至从上个世纪70年代以来分子生物学基因工程迅猛发展，到目前为止DNA合成的方法主要集中3种方法:(I)化学合成方法，由于化学合成的原理决定了化学法合成的DNA片段不可能太长，所以主要用于寡核苷酸的合成；(2) PCR介导的合成方法，这种方法是可以合成大的DNA片段，而且周期也比较短，但是到目前为止，PCR介导的合成方法错误率比较高，尤其对于合成大于2kb以上的DNA由于错误率高，所以为了得到正确的克隆，需要做多次克隆和测序的重复工作，这样成本会很高；而且由于是PCR介导的方法，需要DNA高温聚合酶和DNTP等试剂，这样成本会比较高；(3)非PCR介导的方法，到目前为止报道的基于非PCR的DNA合成方法主要是DNA的固相合成技术。这种固相合成技术，在合成中的`错误率确实大大降低了很多，但是由于在合成的时候引物需要经过特殊的修饰，再加上该方法需要建库，引物成本会比较高；其次是由于该方法每次只能增加3个碱基，这样合成的速度会比较慢，特别对于大的DNA片段的合成，周期尤为长，虽然可以实现自动化操作，但是对于一般的实验室研究不是很实用。
[0004]鉴于目前的基因合成的方法中错误率高，合成成本高等问题，有必要寻找新的基因合成方法来解决现有技术存在的问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提出一种在大肠杆菌中一步法合成DNA片段并组装合成基因的一种新的基因合成方法。该方法利用大肠杆菌自身的修复机制，在大肠杆菌中一步法合成DNA片段，并把DNA小片段组装合成基因。主要步骤包括:载体的改造，线性载体的制备，小DNA片段的合成，组装DNA片段的载体的构建，多个300bp左右的DNA片段的组装合成基因。
[0006]具体做法如下:
[0007]I)、构建 LIC 载体 LIC-A。
[0008]以商品化的pet23a和pLP_VSVG载体用常规方法构建T7_sfgfp质粒，以sfgfp-PF/PBR - PR、T7-sfgfp质粒为模板，通过PCR扩增得到线性载体骨架LIC (3.5kb)(序列列表对应为NOl);设计SPC-PF/SPC-PR(序列见表1)为两对引物，以T7_sfgfp为模板，通过PCR扩增得到SPC盒式结构(Ikb)(序列列表对应为N02)，扩增好的SPC盒式结构的两端都带上了一个限制性酶切位点(BciVI)和13bp的片段填充序列和T7启动子下游的10个碱基的序列；其次，在载体骨架LIC-A和SPC盒式结构两端引入了 20bp的同源序列，扩增获得的SPC盒式结构，通过无酶克隆的方式(Zhu D, Zhong X，Tan R, ChenL,Huang G, Li J, et al.High-throughput cloning of human liver complete openreading frames using homologous recombination in Escherichia col1.[J]AnalBiochem.2010; 397 (2): 162-7)克隆到载体骨架LIC-A上。经过限制性内切酶酶切和测序鉴定得到正确的LIC-A载体质粒(序列列表对应为N03)，命名为LIC-A载体质粒(构建过程见图1)。
[0009]表1骨架载体LIC-A构建中使用的引物
[0010]
【权利要求】
1.一种在大肠杆菌中一步法合成DNA片段并组装合成基因的方法，其特征在于主要步骤包括:构建LIC载体质粒LIC-A ；LIC-A线性载体的制备；构建组装DNA片段的受体载体puc-Kana;选择目标基因，划分300bp左右的小片段进行合成；多个小片段DNA用金门克隆反应组装成大片段基因。
2.根据权利要求1所述的一种在大肠杆菌中一步法合成DNA片段并组装合成基因的方法，其特征在于具体步骤为: 1)、构建LIC载体LIC-A 以商品化的pet23a和pLP_VSVG载体用常规方法构建T7_sfgfp质粒，以sfgfp-PF/PBR - PR、T7-sfgfp质粒为模板，通过PCR扩增得到线性载体骨架LIC ;设计SPC-PF/SPC-PR为两对引物，以T7-sfgfp为模板，通过PCR扩增得到SPC盒式结构；扩增好的SPC盒式结构的两端都带上了一个限制性酶切位点BciVI和13bp的片段填充序列和T7启动子下游的10个碱基的序列；其次，在载体骨架LIC和SPC盒式结构两端引入20bp的同源序列，扩增获得的SPC盒式结构，通过无酶克隆的方式克隆到载体骨架LIC上；经过限制性内切酶酶切和测序鉴定得到正确的LIC-A载体质粒； 2)、LIC-A线性载体的制备(如图2所示)，把测序正确的LIC-A质粒先用限制性内切酶BciVI在37°C酶切，并凝胶回收后的产物，然后再用T4DNA聚合酶3次分别在加dGTP、dCTP、dTTP的保护下12°C利用T4DNA聚合酶消化30min，溶液回收后备用，这样处理的载体在其3’端各突出13nt ； 3)、构建组装DNA片段的受体载体puc-Kana 首先，以PBR322-PF/PBR322-PR为引物，以商品化的puc_19质粒为模板，通过PCR扩增获得线性骨架载体片段PBR322 ;以gfp-PF/gfp-PR为引物，以pGSilG-Lic为模板，通过PCR获得两端带有BspQI酶切位点和EarI酶切位点的gfp盒式结构；以Kana-PF/Kana-PR为引物，以pGSilG-Lic为模板通过PCR扩增，获得Kana盒式结构；其次，通过重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR)将gfp盒式结构和Kana盒式结构拼接成gfp-Kana单元； 最后，将gfp-Kana单元和线性骨架载体片段PBR322进行1:3混合通过无酶克隆方式转化大肠杆菌XL-Gold进行克隆；挑取在蓝光仪下发绿光的菌落，通过质粒电泳、质粒酶切鉴定和质粒测序等方式得到了正确的大小为3686bp的puc-Kana质粒； 4)、选择目标基因，划分300bp左右的小片段进行合成 先选择确定目标基因XY，将需要合成的目标基因的DNA序列按照每300bp左右进行划分为G1、G2、G3、G4、G5……多个小片段，分别设计彼此重叠(over lapping) 17bp左右且无缝的引物序列对，每个300bp左右的片段需要合成12条长度为40-45nt左右的寡核苷酸引物；再分别将合成好的12条寡核苷酸序列稀释成终浓度10 μ Μ，然后分别取0.5 μ L至一 PCR管内， 加2ul的LA Taq Buffer最后加双蒸水至终体积20 μ L混合；分别让其按照94°C 5min, 94°C a37°C slope20min, 37°C 7min的逐步降温的程序退火,且首尾两条引物的5’端分别引入13nt与线性载体同源互补的序列； 将步骤2)准备好的线性载体与退火形成的小DNA片段混合，37°C放置30min后转化大肠杆菌感受态细胞，通过重构T7启动子启动下游报告基因sfgfp的表达，将筛选后测序正确重组子分别命名为XYG1、XYG2、XYG3、XYG4、XYG5......; 5)、多个小片段DNA组装成大片段基因要合成大于300bp以上的DNA片段，需要用步骤4的XYG1、XYG2、XYG3、XYG4、XYG5......质粒作为供体质粒，再另加切好的受体载体质粒puc-Kana做金门克隆反应，这样就合成了与目标基因相同的合成基因 。
【文档编号】C12N15/70GK103725674SQ201310753413
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】马立新, 陈晚苹, 陈羽西, 汪晓娟, 杨琥, 余先红 申请人:湖北大学