烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其编码基因和应用，该烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体由序列表中的序列2经点突变所得，所述点突变为在该序列的第119位，第149位及第59位的至少一个突变。本发明通过对烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶基因序列进行定点突变，最终获得具有高催化活性的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体。且该突变体可通过简单的纯化方案进行高效率的纯化，降低了NAD生产成本，提高了相应产品的市场竞争力。
【专利说明】烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学与生物【技术领域】，尤其涉及一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002]烟酸胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide,缩写 NAD),也称氧化型辅酶I。是一种转递质子(更准确来说是氢离子)的辅酶，它出现在细胞很多代谢反应中。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一种基本的氧化还原辅酶，不论是在呼吸作用还是光合作用过程，它都起着核心枢纽作用。另外，NADH不能直接为分子态氧所氧化，但能通过NADH脱氢酶的作用进行脱氢变成MD。在呼吸链中，通过这种作用，可使黄素、醌、细胞色素等逐步被还原，最后氧被还原成水。这种以NAD为媒介的底物被O2所氧化的途径，是好氧生物的主要有机物的氧化途径。
[0003]目前，工业界、医药界或作为生化试剂使用的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)基本上是通过酵母菌发酵而来。
[0004]烟酰胺腺嘌呤二核苷酸也可通过体外酶催化转化法制备。体外酶催化转化法是将细菌表达的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nicotinamide mononucleotideadeny Iy I transferase, Nmnat)在体外将前体烟酰胺单核苷酸(NMN)和三磷酸腺苷(ATP)催化合成NAD，如吕小群等(2010年，笫二军医大学学报，笫31卷笫II期，笫1251-1254页)描述了一种 体外酶催化生产NAD的方法。在吕小群等描述的方法中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶需用镍凝胶柱纯化，成本较高，从而增加NAD的生产成本。若用烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶粗提物，又因粗提物中存在大量其它可降解ATP和烟酰胺单核苷酸的酶，令昂贵的前体ATP和烟酰胺单核苷酸大量消耗，从而增加NAD的生产成本。
[0005]因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0006]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其编码基因和应用，旨在解决目前烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶纯化效率及催化活力低，NAD生产成本高的问题。
[0007]本发明的技术方案如下:
一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，由序列表中的序列2经点突变所得，所述点突变为在该序列的第119位，第149位及第59位的至少一个突变。
[0008]所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体还包括其变体，其中包括所述序列2所示氨基酸序列中除第119位、第149位和第59位外的其它位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸形式、氨基端截断形式、羧基端截断形式，及所述序列2的部分或全部串联重复形式。
[0009]所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，所述点突变具体为:所述序列2的第119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸。
[0010]所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，所述点突变具体为:所述序列2的第149位的天冬氨酸突变为谷氨酸。
[0011]所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，所述点突变具体为:所述序列2的第59位的丝氨酸突变为苏氨酸。
[0012]所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体具有如序列表中序列3、序列4或序列5所示的氨基酸序列。
[0013]一种编码如上所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的基因，其中，所述基因由序列表中序列I所示的核苷酸序列经定点突变所得。
[0014]一种如上所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的应用，其中，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体用于以三磷酸腺苷和烟酰胺单核苷酸为底物制备烟酰胺腺嘌呤
二核苷酸。
[0015]有益效果:本发明提供一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其编码基因和应用，通过对烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶基因序列进行定点突变，最终获得具有高催化活性的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体。且该突变体可通过简单的纯化方案进行高效率的纯化，降低了 NAD生产成本，提高了相应产品的市场竞争力。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶亲本与突变体F119Y之聚丙烯酰胺凝胶电泳图。`
【具体实施方式】
[0017]本发明提供一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其编码基因和应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0018]本发明提供一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其中，由序列表中的序列2(亲本序列)经点突变所得，所述点突变为在该序列的第119位，第149位及第59位的至少一个突变。
[0019]另外，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体还包括其变体，其中包括所述序列2所示氨基酸序列中除第119位、第149位和第59位外的其它位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸形式、氨基端截断形式、羧基端截断形式，及所述序列2的部分或全部串联重复形式。
[0020]较佳实施例中，所述亲本序列中的第119位的苯丙氨酸(Phe)突变为酪氨酸(Tyr);所述亲本序列中的第149位的天冬氨酸(Asp)突变成谷氨酸(Glu);和/或所述亲本序列中的第59位的丝氨酸(Ser)突变成苏氨酸(Thr)。经上述定点突变后，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的具体实施例具有如序列表中序列3、序列4或序列5所示的氨基酸序列。
[0021]本发明还提供一种编码所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的基因的DNA，所述基因的DNA由序列表中序列I所示的核苷酸序列经定点突变所得，。通过该基因的DNA可转录表达所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体。主要得到的是序列表中序列3、序列4或序列5所示的氨基酸序列。该烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体可用于以三磷酸腺苷(ATP)和烟酰胺单核苷酸为底物制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。[0022]所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的制备的大致过程为:首先构建含有亲本烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶基因的载体质粒，然后设定定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类，再合成适当的引物，以所述的含亲本烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶基因的载体质粒为模板，PCR扩增DNA片段、装配所扩增的DNA片段以及PCR扩增全长突变基因。然后将该全长突变基因克隆到适当的载体上并转化适当的宿主细胞，经培养筛选出具有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶活性的阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒DNA，进行DNA序列测定分析，以确定引入的突变，在确定目的片段插入到载体上后，可通过LB培养基筛选，从而获得一系列耐热并具高催化活性的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体。上述描述中，其中，亲本是指来自Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661 (詹氏甲烧球菌属)的烟酸胺单核苷酸腺苷转移酶(Nmnat)，其核苷酸序列如序列I所示(参考GenBank L77117)，氨基酸序列如序列2所示(参考GenBank NP_247520)
在上述制备方法中，所采用的载体可以为原核表达载体，如pRSET和pES21等；可以为克隆载体，如 PUC18/19 和 pBluscript-SK。
[0023]进一步的，所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体基因可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，当然也可在原核细胞或真核细胞胞外表达。
[0024]进一步地,所述载体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。所述原核细胞可以为大肠杆菌。所述真核细胞可以为酿酒酵母或毕赤巴斯德酵母。
[0025]该突变体可以通过低成本的热处理纯化方案进行纯化，例如将本发明突变体粗提物经70°C热处理10分钟后离心收集上清液，即为部分纯化的酶。并且经上述热处理純化的突变体仍具有高的催化活性，总的来看，本发明的突变体具有比亲本高出至少50%的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶催化活性。
[0026]另外，本发明提供的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的较高催化活性使其可以未经纯化以粗酶形式使用，也可以是经部分纯化的或完全纯化的酶。当然，还可利用固化技术将本发明烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体制成固相酶或固相细胞形式的固化酶。
[0027]在本申请文本中所用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem., 138:9-37，1984)。
[0028]以下用具体的实施例对本发明制备的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其性能进行说明。下列实施例仅用于说明本发明而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。
[0029]实施例1
烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶编码基因的扩增与克隆:
根据基因库(GenBank NP_247520)基因序列设计引物btmj-F和btmj-R (如表1所示)。用引物对 btmj-F 和 btmj-R 从 Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661 中扩增烟酸胺
单核苷酸腺苷转移酶编码基因。
[0030]其扩增条件为:20mM Tris-HCl (pH 8.8)，10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4,2 mMMgSO4,0.1% Triton X-100,50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP，400 nM引物 btmj-F, 400 nM 引物 btmj-R, 1.0 U Pfu DNA 聚合酶(Promega, USA),用接种环挑取少许Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661菌体，再用无菌水调整反应体积至50 ml。
[0031]PCR扩增反应程序为:95°C 3分钟，35圈循环:95°C 50秒、50°C 30秒和72°CI分钟，最后72°C 10分钟。扩增的产物经限制性内切酶NdeI和BamHI酶切后与经同样限制性内切酶NdeI和BamHI酶切的载体pRSET-A (源自Invitrogen，USA)连接，得质粒pRSET-btmj。经DNA测序，确定该被克隆的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的核苷酸序列，具体示于序列表中序列1，相应的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0032]表1
【权利要求】
1.一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其特征在于，由序列表中的序列2经点突变所得，所述点突变为在该序列的第119位，第149位及第59位的至少一个突变。
2.根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体还包括其变体，其中包括所述序列2所示氨基酸序列中除第119位、第149位和第59位外的其它位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸形式、氨基端截断形式、羧基端截断形式，及所述序列2的部分或全部串联重复形式。
3.根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述点突变具体为:所述序列2的第119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸。
4.根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述点突变具体为:所述序列2的第149位的天冬氨酸突变为谷氨酸。
5.根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述点突变具体为:所述序列2的第59位的丝氨酸突变为苏氨酸。
6.根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体具有如序列表中序列3、序列4或序列5所示的氨基酸序列。
7.一种编码如权利要求1-6任一项所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的基因，其特征在于，所述基因由序列表中序列I所示的核苷酸序列经定点突变所得。
8.—种如权利要求1-6任一项 所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的应用，其特征在于，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体用于以三磷酸腺苷和烟酰胺单核苷酸为底物制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
【文档编号】C12N15/54GK103710321SQ201310752930
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】傅荣昭 申请人:邦泰生物工程(深圳)有限公司