用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒及基因芯片的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒以及相应的基因芯片。所述的试剂盒包括：检测人基因组的7个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，所述7个SNP位点是rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787；还包括检测人基因组的4个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，所述4个SNP位点是rs2853668、rs31489、rs402710和rs4635969；还包括检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A的巢氏PCR扩增引物。所述的基因芯片包括：检测人基因组的11个SNP位点的上下游引物和探针，所述11个SNP位点是rs1412829、rs1572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787、rs2853668、rs31489、rs402710、rs4635969；以及检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A的上下游引物和探针。
【专利说明】用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒及基因芯片
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒以及相应的基因芯片，用于预测鼻咽癌发病风险、进行鼻咽癌高危人群筛查以提高鼻咽癌早诊率。
【背景技术】
[0002]鼻咽癌是鼻咽上皮来源的恶性肿瘤，多发于鼻咽顶部和咽隐窝，是一种多因素影响的复杂性疾病，其发生及发展与遗传因素、EBV病毒感染及环境因素密切相关。中国是世界鼻咽癌高发区，据世界卫生组织统计，2008年，中国新发病例占全球39.2%(33101人)，因鼻咽癌死亡病例占全球40.5% (20899人)；并且，鼻咽癌好发于壮年，严重影响人民健康和经济发展。
[0003]近几年，巴德年院士提出的现代“3P”医学理念正不断得到推广。“3P”医学模式，即预测(Prediction)、预防(Prevention)和个体化诊疗(Personalization),强调利用个体基因组等信息，进行疾病的预测和防治，对于疾病的态度由“重治”转变为“重防”。同样，鼻咽癌的防治关键将是进行患病高危人群的筛查，提高早诊率。临床研究发现，鼻咽癌早期治疗效果远高于晚期。临床分期是影响治疗效果的重要因素，早期无局部淋巴结转移鼻咽癌的5年生存率(75.7%)远高于淋巴结转移鼻咽癌(58.2%)和晚期远处转移鼻咽癌(34.9%)。然而，目前仍然缺乏有效的用于高危人群筛查、早期诊断的方法策略，加上鼻咽癌的早期症状无特异性和原发部位较隐蔽，不易被发现，80%鼻咽癌患者就诊时已处于中晚期，治疗效果不理想，导致临床上鼻咽癌的5年生存率一直徘徊于60%左右。进行鼻咽癌高发区人群筛选，能够筛选患病高危人群，提高鼻咽癌早诊率，是提高治疗效果的关键。因而，开发鼻咽癌发病风险预测、用于鼻咽癌高危人群筛查的新型手段具有重要的意义。
[0004]目前临床上提高鼻咽癌早期诊断率主要是通过提高个人健康意识，结合鼻咽腔检查，并利用EB病毒抗体检测技术以评估EB病毒感染情况(详见专利:CN92114135 “一种检测EB病毒抗体的显色试剂及其制造方法”;CN200710027841 “检测多种抗EB病毒抗原抗体的液相芯片试剂盒及其制备方法”;CN201010255146 “EB病毒IgA抗体检测试剂盒(胶体金法)及制备方法”;CN200710029366.1 “检测EB病毒gp78抗体的CBA试剂盒及其制备方法”等)。但是这种策略 难以应用于大规模人群的高危人群筛查以及鼻咽癌的早期预防预警，也未能够有效地提高早诊率。因此，对于鼻咽癌高危人群，根据个体携带鼻咽癌易感基因情况进行鼻咽癌发病风险预测以提高鼻咽癌早诊率显得非常重要。
[0005]遗传因素在不少肿瘤的发生中起到不容忽视的重要作用。在其它相关的恶性肿瘤研究当中，研究者能够利用个体携带易感基因的情况，对其发病风险进行预测。例如，分别携带BRCAl和BRCA2基因突变的女性，罹患乳腺癌的相对风险分别是正常群体的5 —45倍和9 一 21倍；并且，Antoniou等人通过7个风险相关位点联合分析发现,在BRCA2突变携带者中，5%高危组到80岁时发生乳腺癌的可能性为80~96%，而低危组仅为42~50%，指出这些患病风险差异可以用于指导临床方案。然而，目前缺乏有效的鼻咽癌发病风险预测产品。虽然已有个别申请专利根据鼻咽癌相关基因来判定个体对鼻咽癌是否易感的方法，如PLUNC的C-2128T位点、C-1888T位点或由此两位点组成的单倍型(详见专利:CN200510008650.1 “一种检测与鼻咽癌相关的易感基因PLUNC基因型的方法及PLUNC易感基因”)，CYP2E1基因上Rsall多态性，TNF-β基因上G252A位点多态性，GSTMl基因缺失与否(Present/Null)，GSTTl 基因缺失与否(Present/Null)(详见专利:CN201210053659 “鼻咽癌易感基因无创检测试剂盒”)等。然而，该方法仅针对极少数的指标检测，准确率较低；并且，该方法可靠性有待于大规模人群样本进行验证。另外，EB病毒已被国际癌症研究联盟(IARC)确定为I类致癌物，而鼻咽癌与EB病毒有密切的关联。因此，综合考虑基因易感因素和EB病毒因素对鼻咽癌发病风险的预测十分必要。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供了一种用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒以及相应的基因芯片，可同时检测多个鼻咽癌易感基因的SNP位点，可以为个体罹患鼻咽癌风险程度、鼻咽癌高发区人群普查，筛查鼻咽癌发病高危人群以及进行相应预防措施提供参考。
[0007]本发明所述的一种用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒包括:检测人基因组的7个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，所述7个SNP位点是rsl412829、rsl572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787。
[0008]根据本发明所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒的进一步特征，所述检测rsl412829的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2，以及单碱基延伸弓丨物的序列为SEQ ID N0:3 ;所述检测rsl572072的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO:5，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:6 ;所述检测rs28421666的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ IDN0:9 ;所述检测rs2860580的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 12 ;所述检测rs2894207的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID N0:13和SEQ ID NO: 14，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID N0:15;所述检测rs6774494的PCR扩增引物的序列分别为SEQ IDN0:16和SEQ ID NO: 17，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 18 ;所述检测rs9510787的PCR扩增引物的序列分别为SEQID NO: 19和SEQ ID NO:20，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:21。
[0009]根据本发明所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒的进一步特征，所述的试剂盒还包括检测人基因组的4个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，所述4个SNP位点是 rs2853668、rs31489、rs402710 和 rs4635969。
[0010]根据本发明所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒的进一步特征，所述检测rs2853668的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID N0:22和SEQ ID N0:23，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 24 ;所述检测rs31489的PCR扩增引物的序列分别为SEQ IDNO:25和SEQ ID N O:26,以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:27 ;所述检测rs402710的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID N0:28和SEQ ID NO:29，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID N0:30 ;所述检测rs4635969的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID N0:31和SEQID NO:32，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID N0:33。
[0011]根据本发明所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒的进一步特征，所述的试剂盒还包括检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A(GenBank登录号:NC_007605)的巢氏PCR扩增引物。
[0012]根据本发明所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒的进一步特征，所述检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A的巢氏PCR扩增引物的初级PCR引物的序列为SEQ ID N0:34和SEQ ID NO:35，以及次级PCR引物的序列为SEQ IDNO:36 和 SEQ ID NO:37。
[0013]本发明所述的试剂盒以是以本发明人的基于国际范围内最大规模样本量的鼻咽癌人群和正常人对照人群及全基因组水平鼻咽癌易感基因筛查结果的前期研究为基础，结合其它的鼻咽癌相关易感基因，选择11个单核苷酸多态性位点(SNP)及EBV分型信息进行制备的，针对每个位点的引物序列都是经过特异性筛选的。采取受检者外周血、唾液或漱口水来源的基因组DNA，在本发明所述的试剂盒上进行基因分型检测，再利用多重PCR扩增、质谱检测(Sequenom)及桑格(Sanger)测序方法，检测单核苷酸位点，综合分析环境因素(腌制食品食用史、既往吸烟史、新鲜水果蔬菜食用量)、肿瘤家族史及鼻咽癌易感基因位点单核苷酸多态性(SNP)信息，利用遗传风险计分模型，推测受检者罹患鼻咽癌的风险程度，克服了现有的仅仅通过检测EB病毒感染情况、或者依靠极少数且尚待大规模验证的易感基因指标的等结果来进行鼻咽癌发病风险判断的不足。本发明所述的试剂盒能够在受检者任何一个年龄阶段进行检测，结合受检者环境暴露因素，提示受检者不同时期罹患鼻咽癌的风险程度，能够进行大规模人群普查、筛选鼻咽癌发病高危人群，实现鼻咽癌发病风险预测、预警，提高早诊率。
[0014]本发明所述的一种用于鼻咽癌发病风险预测的基因芯片包括:检测人基因组的11个SNP位点的上下游引物和探针，所述11个SNP位点是rsl412829、rsl572072、rs28421666、rs2860580, rs2894207、rs6774494、rs9510787、rs2853668、rs31489、rs402710、rs4635969 ;以及检测检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A的上下 游引物和探针。
[0015]根据本发明所述的用于鼻咽癌发病风险预测的基因芯片的进一步特征，所述检测rsl412829的上下游引物的序列分别为SEQ ID N0:38和SEQ ID N0:39，以及探针的序列为SEQ ID N0:40和SEQ ID N0:41 ;所述检测rsl572072的上下游引物的序列分别为SEQ ID N0:42 和 SEQ ID NO:43，以及探针的序列为 SEQ ID N0:44 和 SEQ ID NO:45 ;所述检测rs28421666的上下游引物的序列分别为SEQ ID N0:46和SEQ ID N0:47，以及探针的序列为SEQ ID N0:48和SEQID NO:49 ;所述检测rs2860580的上下游引物的序列分别为SEQ ID N0:50 和 SEQ ID NO:51，以及探针的序列为 SEQ ID N0:52 和 SEQ ID N0:53;所述检测rs2894207的上下游引物的序列分别为SEQ ID N0:54和SEQ ID N0:55，以及探针的序列为SEQ ID N0:56和SEQ ID NO:57 ;所述检测rs6774494的上下游引物的序列分别为SEQ ID N0:58 和 SEQ ID NO:59，以及探针的序列为 SEQ IDN0:60 和 SEQ ID N0:61 ;所述检测rs9510787的上下游引物的序列分别为SEQID NO:62和SEQ ID N0:63,以及探针的序列为SEQ ID NO:64 SEQ ID NO:65 ;所述检测rs2853668的上下游引物的序列分别为SEQID N0:66和SEQ IDN0:67，以及探针的序列为SEQ ID N0:68和SEQ ID NO:69 ;所述检测rs31489的上下游引物的序列分别为SEQ ID N0:70和SEQ ID NO:71，以及探针的序列为SEQID N0:72和SEQ ID NO:73 ;所述检测rs402710的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75，以及探针的序列为SEQ ID N0:76和SEQID NO:77 ;所述检测rs4635969的上下游引物的序列分别为SEQ ID N0:78和SEQ ID NO:79，以及探针的序列为SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81 ;所述检测检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A (GenBank登录号:NC-007605)的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83，以及探针的序列为 SEQ ID N0:84 和 SEQ ID NO:85。
[0016]本发明所述的基因芯片是以本发明人基于世界范围内最大规模样本量的鼻咽癌人群和正常对照人群，以及全基因组水平鼻咽癌易感基因筛查结果的前期研究为基础，结合新的独立人群研究发现的鼻咽癌相关易感基因，选择11个单核苷酸多态性位点(SNP)及EBV分型信息进行制备的，针对每个位点的引物和探针序列都是经过特异性筛选的结果。采取受检者外周血、唾液或漱口水来源的基因组DNA，在本发明所述的基因芯片上进行基因分型检测，检测这11个单核苷酸位点以及与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A (GenBank登录号:NC_007605)信息；综合受检者各位点的基因型信息，利用遗传风险计分模型，推测受检者罹患鼻咽癌的风险程度。
【具体实施方式】
[0017](一)用于鼻咽癌发病风险预测的与鼻咽癌发病显著相关的SNP位点
[0018]本发明是基于鼻咽癌人群和正常人对照人群的大规模样本量的鼻咽癌全基因组关联分析，以及全基因组水平鼻咽癌易感基因筛查结果的前期研究(A genome-wideassociation study of nasopharyngeal carcinoma identifies three newsusceptibility loci, Jin-Xin Bei et al, Nature Genetics, Volume42, Number7, 600-603，July2010)为基础，同时,发明人利用荟萃分析(meta-analysis)的统计学方法对大规模的全基因组关联数据进行整合分析，获得1300个候选SNP位点，并在独立的广东人群队列(2735例鼻咽癌病人和3112例对照)和广西人群队列(790例鼻咽癌病人和1009例对照)中进行验证，结合HapMap、dbSNP等数据库挑选出SNP位点，并进行位点实验成功率评分，从中确定了与鼻咽癌发病显著相关的11个SNP位点。
[0019]在发明人所研究的队列中，进行了 SNP位点关联分析，挑选的11个位点与鼻咽癌发病关联程度如下表:
[0020]表1:
【权利要求】
1.一种用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: 检测人基因组的7个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，所述7个SNP位点是 rsl412829、rsl572072、rs28421666、rs2860580、rs2894207、rs6774494、rs9510787。
2.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒，其特征在于: 所述检测rsl412829的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ IDNO: 2,以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:3 ； 所述检测rsl572072的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 4 SEQ IDNO: 5,以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:6 ； 所述检测rs28421666的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID N0:7和SEQ IDN0:8，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:9 ； 所述检测rs2860580的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 10和SEQ IDN0:11，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 12 ； 所述检测rs2894207的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 13和SEQ IDNO: 14，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 15 ； 所述检测rs6774494的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 16和SEQ IDNO: 17，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO: 18 ； 所述检测rs9510787的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 19和SEQ IDNO:20, U及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID N0:21。
3.根据权利要求1所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒，其特征在于:还包括检测人基因组的4个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，所述4个SNP位点是rs2853668、rs31489、rs402710 和 rs4635969。
4.根据权利要求3所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒，其特征在于: 所述检测rs2853668的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID N0:22和SEQ IDNO:23, U及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:24 ； 所述检测rs31489的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 25和SEQ IDNO:26,以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:27 ； 所述检测rs402710的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 28和SEQ IDN0:29，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:30 ； 所述检测rs4635969的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO: 31和SEQ IDNO: 32，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID N0:33。
5.根据权利要求3所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒，其特征在于:还包括检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A (GenBank登录号:NC-007605)的巢氏PCR扩增引物。
6.根据权利要求5所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒，其特征在于:所述检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A (GenBank登录号:NC-007605)的巢氏PCR扩增引物的初级PCR引物的序列为SEQ ID NO: 34和SEQ ID NO: 35，以及次级PCR引物的序列为SEQ ID N0:36和SEQ ID N0:37。
7.一种用于鼻咽癌发病风险预测的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括: 检测人基因组的11个SNP位点的上下游引物和探针，所述11个SNP位点是rs 1412829、rsl572072、 rs28421666、 rs2860580、 rs2894207、 rs6774494、 rs9510787、 rs2853668、rs31489、rs402710、rs4635969 ;以及 检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A (GenBank登录号:NC-007605)的上下游引物和探针。
8.根据权利要求7所述的用于鼻咽癌发病风险预测的基因芯片，其特征在于: 所述检测rsl412829的上下游引物的序列分别为SEQ ID N0:38和SEQ IDN0:39，以及探针的序列为SEQ ID N0:40和SEQ ID NO:41 ； 所述检测rsl572072的上下游引物的序列分别为SEQ ID N0:42和SEQ IDN0:43，以及探针的序列为SEQ ID N0:44和SEQ ID NO:45 ； 所述检测rs28421666的上下游引物的序列分别为SEQ ID N0:46和SEQ IDN0:47，以及探针的序列为SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49 ； 所述检测rs2860580的上下游引物的序列分别为SEQ ID N0:50和SEQ IDN0:51，以及探针的序列为SEQ ID N0:52和SEQ ID NO:53 ； 所述检测rs2894207的上下游引物的序列分别为SEQ ID N0:54和SEQ IDN0:55，以及探针的序列为SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57 ； 所述检测rs6774494的上下游引物的序列分别为SEQ ID N0:58和SEQ IDN0:59，以及探针的序列为SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61 ； 所述检测rs9510787的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:62和SEQ IDNO:63，以及探针的序列为SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65 ； 所述检测rs2853668的上下游引`物的序列分别为SEQ ID NO:66和SEQ IDNO:67，以及探针的序列为SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69 ； 所述检测rs31489的上下游引物的序列分别为SEQ ID N0:70和SEQ ID NO:71，以及探针的序列为 SEQ ID NO:72 和 SEQ ID NO:73 ； 所述检测rs402710的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:74和SEQ IDNO:75，以及探针的序列为 SEQ ID NO:76 和 SEQ ID NO:77 ； 所述检测rs4635969的上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:78和SEQ IDNO:79，以及探针的序列为 SEQ ID NO:80 SEQ ID NO:81 ； 所述检测与鼻咽癌相关的EB病毒亚型特异性的单核苷酸多态性位点G155391A(GenBank登录号:NC_007605)的上下游引物的序列分别为SEQ IDNO:82和SEQ ID NO:83,以及探针的序列为SEQ ID N0:84和SEQ ID NO:85。
【文档编号】C12Q1/68GK103757104SQ201310752858
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2012年12月28日
【发明者】曾益新, 崔倩, 贾卫华, 贝锦新, 徐淼, 刘稳升 申请人:中山大学肿瘤防治中心