一种β-内酰胺酶培养基平板的活性检测方法
【专利摘要】本发明涉及β-内酰胺酶的活性检测，尤其涉及一种β-内酰胺酶培养基平板的活性检测方法，该方法包括以下的步骤：1）根据不同检测限，配制不同浓度的青霉素缓冲溶液；2）平板中加入1～5mL青霉素，均匀覆盖平板，30～40℃反应；3）取反应液于试管中，加入1～5mL中性羟胺，中性羟胺溶液，中性羟胺溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，反应一段时间；4）将3）中的混合液加入与中性羟胺等反应量的硫酸铁胺，观察溶液颜色变化，若混合液颜色为红棕色，样品活性低于检测限；若为黄色，样品活性高于检测限；本发明由于采用了上述的技术方案，该方法能快速、高效、准确地检测出添加于固体培养基中的β-内酰胺酶的酶活性。
【专利说明】一种β-内酰胺酶培养基平板的活性检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及β -内酰胺酶的活性检测，尤其涉及一种β -内酰胺酶培养基平板的活性检测方法。
【背景技术】
[0002]近十年来，因β_内酰胺类抗生素的大量及广泛使用，尤其是青霉素与头孢类抗菌药的使用，对β_内酰胺类抗生素的各种抗菌药的耐药性不断增强，该耐药菌的出现加剧了各种难治性感染，使得治疗十分棘手。许多细菌产生内酰胺酶，在临床上由于某些致病菌产生β-内酰胺酶，使β -内酰胺类抗生素治疗这些病菌所引起的疾病发生了困难。在β_内酰胺类抗生素的生产过程中，由于灭菌不彻底或其它原因，也有可能造成产β_内酰胺酶的杂菌污染，内酰胺类抗生素的产量就会受到影响。
[0003]产生β_内酰胺酶是出现耐药性的最主要原因，使内酰胺类抗生素失效的机理，是由于它将内酰胺类抗生素分子中的内酰胺环水解，形成青霉噻唑酸。由于普通的无菌培养基平皿难以应付内酰胺类抗生素生产车间的无菌环境监测，会造成微生物检验中出现假阴性结果。因此， 申请人:申请了中国发明专利申请(申请号:201410192279.8申请日:2014-05-08)公开了一种抗生素生产车间环境监测用无菌培养基平皿及其制备方法，所述的抗生素为β_内酰胺类抗生素，在培养基平皿内设置培养基，培养基中添加了与所述的内酰胺类抗生素相对应的内酰胺酶，内酰胺酶的添加量为10万?800万单位/皿。
[0004]然而，目前中国药典中只有对液体内酰胺酶活性检测方法的规定，而对添加于固体培养基中的β -内酰胺酶如何检测其酶活并无有关规定与标准，国内外文献也没有相关报道。这样导致市场上很多厂家生产的添加内酰胺酶平皿产品酶活性不合格，但是无法检测与判断其酶活性。
【发明内容】
[0005]为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种内酰胺酶培养基平板的活性检测方法，该方法能快速、高效、准确地检测出添加于固体培养基中的β -内酰胺酶的酶活性。
[0006]为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案:
一种β -内酰胺酶培养基平板的活性检测方法，该方法包括以下的步骤:
1)根据不同检测限，配制不同浓度的青霉素缓冲溶液；
2)平板中加入I飞mL青霉素，均匀覆盖平板，3(T40°C反应；
3)取反应液于试管中，加入Γδπι?中性羟胺，中性羟胺溶液，中性羟胺溶液的浓度为0.Γ0.5mol/L，反应一段时间；
4)将3)中的混合液加入与中性羟胺等反应量的硫酸铁胺，观察溶液颜色变化，若混合液颜色为红棕色，样品活性低于检测限；若为黄色，样品活性高于检测限；所述的检测限设置如下所示:
①检测限25万单位,步骤I)中青霉素浓度为4mg/mL,步骤2)中反应时间为60min ；
②检测限50万单位,步骤I)中青霉素浓度为4mg/mL,步骤2)中反应时间为30min；
③检测限100万单位,步骤I)中青霉素浓度为4mg/mL,步骤2)中反应时间为20min；
④检测限200万单位，步骤I)中青霉素浓度为8mg/mL，步骤2)中反应时间为30min；
⑤检测限300万单位，步骤I)中青霉素浓度为8mg/mL，步骤2)中反应时间为20min；
⑥检测限400万单位，步骤I)中青霉素浓度为15mg/mL，步骤2)中反应时间为22min；
⑦检测限550万单位，步骤I)中青霉素浓度为20mg/mL，步骤2)中反应时间为20min；
⑧检测限650万单位，步骤I)中青霉素浓度为25mg/mL，步骤2)中反应时间为20min；
⑨检测限800万单位，步骤I)中青霉素浓度为30mg/mL，步骤2)中反应时间为15min。
[0007]作为优选，所述的步骤I)中缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，浓度为50 mmol/L,pH 7.0。
[0008]作为优选，所述的步骤2)中，反应温度为35°C。
[0009]作为优选，所述的步骤3)中，中性羟胺溶液的浓度为0.125 mol/L, pH 6.75。
[0010]作为优选，所述的中性羟胺溶液为盐酸羟胺与碱性缓冲液混合制得，碱性缓冲液pH 12.5，由氢氧化钠4.32 g，三水合乙酸钠0.862 g水溶后，定容至500 mL制得。
[0011]作为优选，所述的步骤4)中，硫酸铁胺采用0.25 mol/L硫酸铁胺。
[0012]本发明由于采用了上述的技术方案，该方法能快速、高效、准确地检测出添加于固体培养基中的β-内酰胺酶的酶活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为实施例1加入25 mg/mL的青霉素钠溶液的平皿中，35°C反应20 min的显色照片。
[0014]图2为实施例1加入20 mg/mL的青霉素钠溶液的平皿中，35°C反应20 min的显色照片。
[0015]图3为实施例2加入15 mg/mL的青霉素钠溶液的平皿中，35°C反应22 min的显色照片。
[0016]图4为实施例2加入8 mg/mL的青霉素钠溶液的平皿中，35°C反应20min的显色照片。
【具体实施方式】
[0017]试剂配制
(I)中性羟胺溶液
0.25 mol/L盐酸羟胺:取盐酸羟胺8.685 g，以水溶解，定容至500 mL。
[0018]碱性缓冲液(pH 12.5):取氢氧化钠4.32 g，三水合乙酸钠0.862 g水溶后，定容至 500 mL。
[0019]0.125 mol/L中性羟胺(pH 6.75):0.25 mol/L盐酸羟胺与碱性缓冲液等体积混八口 ο
[0020](2)硫酸铁胺溶液
0.15 mol/L硫酸溶液-M 4.1 mL98%的浓硫酸，定容至500 mL。
[0021]0.25 mol/L硫酸铁胺:取硫酸铁胺60.25 g，以0.15 mol/L硫酸溶液悬浮，加热使之溶解，冷却后以0.15 mol/L硫酸定容至500 mL。
[0022](3)硫酸铁胺试纸条
将裁剪好的吸水纸浸泡于硫酸铁胺溶液中4 h，烘箱中60°C过夜烘干。
[0023]⑷缓冲液
50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0):取十二水合磷酸氢二钠6.80 g与二水合磷酸二氢钠4.84 g，溶于水后定容至1000 mL。
[0024](4)检测用底物
根据不同检测限，用缓冲液配制对应浓度的青霉素钠。
[0025]实施例1
1.取青霉素酶冻干粉(杭州北望生物技术有限公司，批号:20140613)—瓶，采用中国药典中的淀粉碘法测得青霉素酶活性1264万单位/瓶。
[0026]2.将青霉素酶冻干粉溶解于2 mL磷酸缓冲液(pH7.0)中，制成632万单位/mL的青霉素酶液。
[0027]3.取I mL青霉素酶液加入平皿中，加入19 mL冷却至55°C的胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)，轻微摇晃均匀，平置于桌面。待培养基凝固，制得添加青霉素酶培养基平皿，编号为样品皿1，活性为632万单位/皿。
[0028]4.配制浓度为25 mg/mL的青霉素钠溶液，取2 mL加入步骤3制备好的平皿中，35°C反应20 min。取0.5 mL反应液于试管中，加入0.5 mL中性羟胺，反应3 min，然后加Λ 0.5 mL硫酸铁胺，观察溶液颜色如图1。根据检测限表，检测出样品皿I中青霉素酶活性〈650万单位/皿。
[0029]5.配制浓度为20 mg/mL的青霉素钠溶液，取2 mL加入步骤3制备好的平皿中，35°C反应20 min。取0.5 mL反应液于试管中，加入0.5 mL中性羟胺，反应3 min，然后加Λ 0.5 mL硫酸铁胺，观察溶液颜色如图2。根据检测限表，检测出样品皿I中青霉素酶活性>550万单位/皿。
[0030]6.通过步骤4和步骤5得到结论:550万单位/皿〈样品皿1〈650万单位/皿。样品皿I的实际酶活632万单位/皿，因此结果符合。
[0031]实施例2
1.取头孢菌素酶冻干粉(杭州北望生物技术有限公司，批号:20140524) —瓶，采用中国药典中的淀粉碘法测得头孢菌素酶活性368万单位/瓶。
[0032]2.将头孢菌素酶冻干粉溶解于I mL磷酸缓冲液(pH7.0)中，制成368万单位/mL的头孢菌素酶液。
[0033]3.取I mL头孢菌素酶液加入平皿中，加入19 mL冷却至55°C的营养琼脂培养基(NA)，轻微摇晃均匀，平置于桌面。待培养基凝固，制得添加头孢菌素酶培养基平皿，编号为样品皿2，活性为368万单位/皿。
[0034]4.配制浓度为15 mg/mL的青霉素钠溶液，取2 mL加入步骤3制备好的平皿中，35°C反应22 min。取0.5 mL反应液于试管中，加入0.5 mL中性羟胺，反应3 min，然后加Λ 0.5 mL硫酸铁胺，观察溶液颜色如图3。根据检测限表，检测出样品皿2中青霉素酶活性〈400万单位/皿。
[0035]5.配制浓度为8 mg/mL的青霉素钠溶液，取2 mL加入步骤3制备好的平皿中，35°C反应20 min。取0.5 mL反应液于试管中，加入0.5 mL中性羟胺，反应3 min，然后加Λ 0.5 mL硫酸铁胺，观察溶液颜色如图4。根据检测限表，检测出样品皿2中青霉素酶活性>300万单位/皿。
[0036]6.通过步骤4和步骤5得到结论:300万单位/皿〈样品皿1〈400万单位/皿。样品皿2的实际酶活368万单位/皿，因此结果符合。
【权利要求】
1.一种β-内酰胺酶培养基平板的活性检测方法，其特征在于该方法包括以下的步骤: 1)根据不同检测限，配制不同浓度的青霉素缓冲溶液； 2)平板中加入f5mL青霉素缓冲溶液，均匀覆盖平板，3(T40°C反应； 3)取反应液于试管中，加入r5mL中性羟胺溶液，中性羟胺溶液的浓度为0.Γ0.5mol/L,反应一段时间； 4)将3)中的混合液加入与中性羟胺等反应量的硫酸铁胺，观察溶液颜色变化，若混合液颜色为红棕色，样品活性低于检测限；若为黄色，样品活性高于检测限；所述的检测限设置如下所示: ①检测限25万单位,步骤I)中青霉素浓度为4mg/mL,步骤2)中反应时间为60min ； ②检测限50万单位,步骤I)中青霉素浓度为4mg/mL,步骤2)中反应时间为30min； ③检测限100万单位,步骤I)中青霉素浓度为4mg/mL,步骤2)中反应时间为20min； ④检测限200万单位，步骤I)中青霉素浓度为8mg/mL，步骤2)中反应时间为30min； ⑤检测限300万单位，步骤I)中青霉素浓度为8mg/mL，步骤2)中反应时间为20min； ⑥检测限400万单位，步骤I)中青霉素浓度为15mg/mL，步骤2)中反应时间为22min； ⑦检测限550万单位，步骤I)中青霉素浓度为20mg/mL，步骤2)中反应时间为20min； ⑧检测限650万单位，步骤I)中青霉素浓度为25mg/mL，步骤2)中反应时间为20min； ⑨检测限800万单位，步骤I)中青霉素浓度为30mg/mL，步骤2)中反应时间为15min。
2.根据权利要求1所述的一种内酰胺酶培养基平板的活性检测方法，其特征在于，步骤I)中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，浓度为50 mmol/L, pH 7.0o
3.根据权利要求1所述的一种内酰胺酶培养基平板的活性检测方法，其特征在于，步骤2)中，反应温度为35°C。
4.根据权利要求1所述的一种内酰胺酶培养基平板的活性检测方法，其特征在于，步骤3)中，中性羟胺溶液的浓度为0.125 mol/L, pH 6.75。
5.根据权利要求1或4所述的一种β-内酰胺酶培养基平板的活性检测方法，其特征在于，中性羟胺溶液为盐酸羟胺与碱性缓冲液混合制得，碱性缓冲液PH 12.5，由氢氧化钠4.32 g，三水合乙酸钠0.862 g水溶后，定容至500 mL制得。
6.根据权利要求1所述的一种内酰胺酶培养基平板的活性检测方法，其特征在于，步骤4)中，硫酸铁胺采用0.25 mol/L硫酸铁胺。
【文档编号】C12Q1/34GK104263808SQ201410437817
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】沈祝飞, 张加慧, 周冰 申请人:杭州北望生物技术有限公司