一种蚯蚓中蚓激酶的纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分离纯化蚯蚓提取物(蚓激酶)的方法，特别是涉及CM SephadexC-50阳离子交换层析和S^hadex G-75凝胶过滤层析对蚯蚓提取物进行蛋白分离纯化，且蛋白组分具有较高的纤溶蛋白酶活性的方法。
【背景技术】
[0002]蚯蚓在中医上又称地龙，我国传统的中医药学中，蚯蚓作为中药具有解热、定惊、利尿、降压等功效。蚯蚓体内的蛋白质含量非常丰富，且具有人体所需的10种氨基酸，其含量和营养价值都很高，甚至超过大豆蛋白。而且其体内的不饱和脂肪酸含量高，尤其是亚油酸，其具有抗癌、降血压，防止动脉硬化的作用。此外维生素和微量元素含量也很丰富，蚯蚓的药用价值已成为人们研究蚯蚓的热点。
[0003]目前研究的最多的是蚯蚓体内的酶，包括其中的血纤蛋白溶酶(也叫纤溶酶)、胶原蛋白酶等，还有蚯蚓超氧化物歧化酶、蚯蚓过氧化氢酶，蚯蚓金属硫蛋白酶等。
[0004]1982年Mihara自Lumbrwus rubeHus中提取出一组具有纤溶活性的纤溶酶，命名为蚓激酶(lumbrmonase)。由于蚓激酶具有治疗心脑血管疾病的性质，而使其成为研究的热点。蚓激酶具有直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原间接溶解纤维蛋白的双重作用。在临床上，该酶可口服后经肠胃进入血液，同时可降低血液粘滞度、改善微循环。对缺血性心脑血管病、陈旧性血栓病、高血压、动脉硬化、心肌梗塞等具有较好治疗作用，尤其对因脑血管病导致的肢体瘫痪及语言障碍的恢复效果显著。其特点是稳定性好、纤溶活性强、药理作用广泛、口服有效、副作用小，许多国内外科研人员都在致力于这类新的溶栓酶类新药开发。此后，人们从不同的蚯蚓品种中获得该酶，且对其研究也同益深入。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种采用CM Sephadex C-50阳离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析对蚯蚓提取物进行蛋白分离纯化，且蛋白组分具有较高的纤溶蛋白酶活性的方法。
[0006]本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
[0007]—种蚯蚓中蚓激酶的纯化方法，该方法包括如下步骤:
[0008]第一步，蚯蚓组织匀浆制备:吐净泥沙后的蚯蚓采用组织匀浆机分别制备得到含有蚯蚓体腔液的混合液和剩余皮渣；将含有蚯蚓体腔液的混合液高速离心分别得到蚯蚓体腔液和体腔液中的沉淀部分；所述剩余皮渣和所述体腔液中的沉淀部分进行细胞粉碎，粉碎后的产物和所述的蚯蚓体腔液再次混合和离心，离心取上清液。
[0009]在一些技术方案中，第一步中所述的艇顿为大平2号。
[0010]第二步，硫酸铵沉淀法纯化蛋白组分:在所述的上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，加入完毕后搅拌8?15h，搅拌后离心，取沉淀。
[0011]在一些的技术方案中，第二步中在加入饱和硫酸铵之前先加入EDTA-Na2溶液，以减少硫酸铵溶液中残留的重金属离子造成蛋白质变性的可能性。在一些优选的技术方案中，搅拌是在温度为O°C的条件下搅拌12h，离心的条件是以转速为10000r/min离心15min。
[0012]在一些优选的技术方案中，第二步中上清液与饱和酸铵溶液的体积为I?3:1。
[0013]第三步，透析去盐:在第二步中的沉淀中加入PBS缓冲液并摇匀至无沉淀，得到混合液；将该混合液灌入透析袋，并将透析袋置于PBS缓冲液中，对透析后产物进行离心，离心后取上清液即为蚯蚓蛋白粗提物。
[0014]在一些技术方案中，第三步中的离心是以转速为10000r/min离心15min。
[0015]在一些优选的技术方案中，第三步中所述的PBS缓冲液的pH = 7.6，浓度为0.2mol/L0
[0016]第四步，CM Sephadex C-50阳离子交换层析:选用尺寸为40*700mm、预处理过的层析柱，在该层析柱中装入凝胶填料，填料后在层析柱顶端缓慢加入所述的蚯蚓蛋白粗提物，并用NaCl进行阶段性梯度洗脱，流速为0.15?0.45ml/min，收集洗脱液；对洗脱液进行鉴定，选取具备溶解血栓功效的洗脱液，待用；
[0017]该步骤中凝胶填料的制备方法为:按I g CM Sephadex C-50干粉加入30ml、0.2mol/L、pH = 7.6的PBS缓冲液的比例进行配置，配置后在沸水浴中浸泡的同时缓慢搅动，使组分混匀。浸泡后凝胶膨胀有一些凝胶颗粒悬浮在溶液中，此时倾倒掉上层溶液以去除这些凝胶颗粒，反复进行，直至除尽悬浮凝胶颗粒。
[0018]在一些技术方案中，第四步的装入凝胶填料具体步骤为:层析柱固定在铁架台上，在铁架台上悬一细绳作为参照，使层析柱保持与地面垂直，封闭层析柱下端，沿管壁缓缓倒入少许缓冲液，再将凝胶溶液一边用玻璃棒搅动一边缓缓连续加入柱内，至柱高75 %?80%左右，利用缓冲液冲洗层析柱末端，以排除凝胶柱中死角内的空气，确保凝胶柱中无气体介质。立即用缓冲剂填满层析柱中剩余区域，并将层析柱顶端与动力栗相连，打开层析柱底端出水口，用缓冲液平衡层析柱内环境，使其性质稳定。
[0019]在一些技术方案中，第四步的加样及梯度式洗脱具体步骤为:从层析柱顶端用移液枪缓缓加入蚯蚓蛋白粗提物，用NaCl(0.1?lmol/L)进行阶段性梯度洗脱，自动部分收集齐收集洗脱液，1min/管，利用紫外核酸蛋白仪测定洗脱液280nm波长处的光吸收度值(A280nm)，根据A280nm的大小绘制洗脱曲线。
[0020]在一些优选的技术方案中，第四步中蚯蚓蛋白粗提物的加入量为4?6mL。第四步的整个操作过程均在温度为4°C的条件下进行。
[0021]第五步，Sephadex G-75凝胶过滤层析:选用尺寸为24*900mm、预处理过的层析柱，在该层析柱中装入凝胶填料，填料后将第四步待用的洗脱液在层析柱顶端缓慢加入，并用蒸馈水进行洗脱，流速为I?2.5ml/min，收集洗脱液；
[0022]该步骤中凝胶填料的制备方法为:按Ig Sephadex G-75干粉加入20ml、0.2mol/L、pH = 7.6的PBS缓冲液的比例进行配置，配置后在沸水浴中浸泡的同时缓慢搅动，使组分混勾。
[0023]在一些技术方案中，第五步的装入凝胶填料具体步骤为:将层析柱垂直安置在无直接光照、无空气对流处，防止层析柱内产生气泡，取3/4体积的凝胶和1/4体积的pH =7.6的0.01mol/L PBs缓冲液制成凝胶浆。沿柱子一侧倾入凝胶浆，一次性完成，确保柱床均一。按凝胶体积加入2倍体积缓冲液。
[0024]在一些技术方案中，第五步的样品上柱及洗脱具体步骤为:加入5ml CM-SephadexC-50阳离子交换层析经鉴定具有活性的组分，利用Sephadex G_75凝胶过滤层析进行脱盐和进一步纯化。样品上样后，用双蒸水洗脱，流速为1.8ml/min，部分收集器收集洗脱液，1min/管，利用紫外核酸蛋白仪测定洗脱液280nm波长处的光吸收度值(A28J，根据Aafflnni的大小绘制洗脱曲线。
[0025]在一些优选的技术方案中，第四步和第五步在装柱前，对凝胶进行排气处理，确保凝胶中无气体介质，将凝胶倒入一抽滤瓶中，将抽滤瓶口用橡胶塞密封，0.1MPa真空栗抽气，同时晃动抽滤瓶，使气泡更容易溢出，在凝胶不冒气泡后1min停止抽气或抽气lh。
[0026]在一些优选的技术方案中，第四步和第五步中，层析柱预处理均是依次用高锰酸钾和二甲基二氯硅烷处理管壁。
[0027]本发明技术方案所述的纯化方法还包括分子量测定，分子量测定用凝胶成像法，将SDS-PAGE样品凝胶，在B1sens SC805凝胶成像系统上成像，以Maker为对照，通过系统软件计算样品分子量。
[0028]在本发明技术方案中，蛋白质的等电点是进行离子交换层析的重要依据，与等电聚焦电泳一样，离子交换层析法利用不同蛋白质表面电荷性质的不同达到分离、纯化蛋白质的目的。凝胶过滤层析是根据蛋白质分子量大小不同而达到分离效果，凝胶填料中含有大量微孔，只允许缓冲液及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质及一些蛋白复合物被阻挡在外。因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比低分子量蛋白更早的被洗脱下来。
[0029]本发明的有益效果:
[0030]本发明技术方案采用离子交换层析对蛋白质的分辨率高、操作简易，重复性好，成本低。
【附图说明】
[0031]图1为CM-Sephadex C-50阳离子交换层析色谱。
[0032]图2为S印hadex G-75凝胶过滤层析对ACAE-C组分分离纯化色谱。
[0033]图3为Sephadex G_75凝胶过滤层析对ACAE-D组分分离纯化色谱。
[0034]图4为ACAE-C和ACAE-D的分子量测定。
【具体实施方式】
[0035]以下结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此:
[0036]实施例
[0037]第一步，蚯蚓组织匀浆制备:取鲜蚯蚓经清水洗净后，置于0.2mol/LpH = 7.0的PBS缓冲液中，隔夜，吐净泥沙。对