专利名称：蚓激酶分离工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学制药技术，具体地说，是涉及静脉注射用的蚓激酶分离工艺。
文献报道，蚯蚓中成分复杂，其分子量在14000～60000范围内的蚓激酶高达10种，且均有溶栓活性。多大分子量范围的蚓激酶收率高，活性强，致敏性低，如何提纯并除掉过敏物质和细菌内毒素，同时实现工业化均不清楚。有的从蚯蚓中提纯了分子量为60000的蚓激酶，但动物实验产生强烈的过敏反应。有的从蚯蚓中提纯了含有两个亚基的分子量为45000的蚓激酶，所含两个亚基的分子量为26000和18000，该酶溶栓活性较低，其分离后的两个亚基则基本无活性。有的将蚯蚓洗净后用0．2摩尔PH4．6～4．8的柠檬酸钠制成匀浆，经1000～4000转／分钟离心20～40分钟，再经GSAC亲和、DEAE-52纤维素离子交换和丙烯葡聚糖S-200分子筛柱层析分离出分子量为3．0、2．5及2．2万的三种活性蛋白质，但不能达到最佳效果。总之，目前国内外尚未见到用规模化生产的分离工艺技术，从蚯蚓中纯化出SDS-聚丙烯酰胺电泳为一条带或二条带，分子量在25000～30000之间，高活性，且细菌内毒素和过敏性均达到的静脉注射要求的蚓激酶的报道。
1992年卫生部批准的蚓激酶胶囊经近年临床使用情况表明，由于蚓激酶属于酶类制剂，口服后易在胃肠道破坏，且吸收作用缓慢，不能发挥出溶解血栓的主要作用。因此，我们将其给药途径改变为静脉注射，使蚓激酶的生物利用度和溶解血栓的作用得到充分的提高，避免胃肠道的破坏作用，使蚓激酶真正发挥出溶解血栓药理作用。迄至今日，研制出既能适合工业化生产又能分离出致敏性低无热原符合静脉注射要求的蚓激酶的生产工艺是急待解决的技术关键。
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，而提供产品无热源、无过敏、符合静脉注射要求、适合工业化生产的蚓激酶的分离工艺。
本发明的目的可以通过以下措施来达到蚓激酶的分离工艺是将新鲜的蚯蚓用水洗净，食盐处理，蚯蚓∶食盐按重量比为1∶0．02～0．2，洗净；加缓冲液，蚯蚓∶0．02～0．3摩尔三羟甲基氨基甲烷或磷酸缓冲液按W／V比为1∶1～3，PH7．3～8．8制成匀浆；6000～12000转／分钟，离心30～60分钟；上清液加热50～62℃，30～60分钟，沉淀杂蛋白后，再同法离心，得上清滤液；通过亲和层析收集总蚓激酶；分离用离子交换层析1；精制用分子筛层析或离子交换层析2，得分子量为30000±400，29000±400，28000±400，27000±400，25000士400和23000±400的蚓激酶；用超滤法除掉细菌内毒素后，分子量不同的蚓激酶原料药加辅料或注射用水，制成蚓激酶的粉针剂和水针剂。亲和层析的配基为精氨酸、苯甲脒、慈菇蛋白酶抑制剂和大豆(或利马豆)胰蛋白酶抑制剂，洗脱液为0．005～1．0摩尔精氨酸，PH5．0～8．0和PH9．5～11．5的氨水。离子交换层析1采用羧甲基-或DEAE-葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶柱层析，用0～1．5摩尔氯化钠梯度洗脱分离出分子量不同的蚓激酶。分子筛层析采用葡聚糖凝胶-G75，离子交换层析2采用Mono-Q或Q-琼脂糖凝胶H．P层析，用0～1．5摩尔氯化钠缓冲液进行洗脱，制成分子量不同的蚓激酶溶液。超滤法采用3～5万的超滤膜或超滤柱进行超滤，制成分子量不同的蚓激酶原料药。新鲜活的蚯蚓是双胸蚓、赤子爱胜蚓、广地龙和锯齿远蚓。
上清滤液，即粗蚓激酶；总蚓激酶，即不同分子量的蚓激酶；离子交换层析1目的是将总蚓激酶分离为分子量不同范围的蚓激酶；精制目的是将分子量不同范围的蚓激酶精制成分子量不同的蚓激酶溶液。辅料包括右旋糖酐和甘露醇。
采用SDS-聚丙烯酰胺电泳法检测各部分纯度及分子量分布。采用Folin法测定蛋白含量。细菌内毒素依法检查(中国药典2000年版二部附录XI E)。
过敏试验，取本品适量，以氯化钠注射液配成每1毫升中含37．5微克的溶液，分别做为致敏溶液及供试品溶液。取体重250-300克健康豚鼠6只，间日腹腔注射致敏0．5毫升／只，连续3次，于第3次给药后的14天自静脉注射供试品溶液1．0毫升／只，注射后15分钟内动物应不得出现连续干咳，明显耸毛，四肢发软，干呕等现象中的两种以上者或者有躺卧，呼吸困难，痉挛，虚脱及死亡现象之一者，应判为阳性。
本发明相比现有技术具有如下优点经鉴定不同分子量的蚓激酶均为蛋白水解酶，具有高效、溶栓、抗凝、极低毒性、化学性质稳定、无热源、无过敏，可制成粉针剂和水针剂，用于治疗心肌梗塞和脑梗塞；另外，原料来源丰富、价格低廉，适合工业化生产。
图1蚓激酶的分离工艺流程下面结合图和实施例，对本发明加以进一步说明实施例1称取1．0公斤新鲜活的双胸蚓用自来水洗净，加20克精盐并搅动后，使蚯蚓吐出大量粘液，再用水洗涤干净，加1．5升0．1摩尔三羟甲基氨基甲烷(PH7．3)，用胶体研磨粉碎，于4℃、12000转／分钟离心30分钟，取上清液置62℃水浴中加热50分钟，再离心1次，上清液用0．45um微孔滤膜过滤得上清滤液1．2升，将上清滤液加入以苯甲脒为配基的亲和层析柱进行亲和层析，控制流速30毫升／小时，待样品完全进入胶床后，将胶面上部填满平衡缓冲液，洗脱至基线。用1．0摩尔精氨酸(PH7．0)洗脱活性峰至基线，活性峰用0．02摩尔磷酸缓冲液(PH7．8)反复透析至PH7．8，即得总蚓激酶360毫克。
总蚓激酶进行羧甲基-葡聚糖凝胶-C50柱层析，控制流速30毫升／小时，用0～1．0摩尔氯化钠进行梯度洗脱，按先后顺序收集A、B和C。A峰产量为4．0毫克，B峰产量为140毫克，C峰产量为208毫克。
10毫克B峰用0．02摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸(PH7．3)的平衡液透析至平衡，进行Mono-Q层析柱分离，控制流速1．0毫升／分钟，用0～0．3摩尔氯化钠进行梯度洗脱，按先后顺序收集分子量为25000±400、27000±400和28000±400的蚓激酶，电泳均为一条带。
各部分用3万超滤柱超滤分离出分子量不同的蚓激酶原料药，加甘露醇和注射用水至一定浓度，用0．22um微孔滤膜过滤，经分装和冻干制成粉针剂，均符合静脉注射的要求。
实施例2称取1．0公斤鲜活的赤子爱胜蚓用自来水洗净，加50克精盐并搅动后，使蚯蚓吐出大量粘液，再用超纯水洗涤干净，加1．0升0．2摩尔磷酸缓冲液(PH7．8)，用胶体研磨粉碎，于4℃、8000转／分钟离心60分钟，取上清液置60℃水浴中加热60分钟，再离心1次，上清液用0．45um微孔滤膜过滤得上清滤液1．2升。
将上清滤液0．4升分三次加入以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基的亲和层析柱，进行亲和层析，控制流速30毫升／小时，待样品完全进入胶床后，将胶面上部填满平衡缓冲液，洗脱至基线。分别用氨水(PH9．5)、氨水(PH10．5)和氨水(PH11．5)洗脱活性峰至基线，活性峰用0．02摩尔磷酸缓冲液(PH7．8)反复透析，分别获得总蚓激酶192毫克、198毫克和206毫克。
总蚓激酶进行DEAE-葡聚糖凝胶-A50柱层析，控制流速30毫升／小时，用0～1．3摩尔氯化钠进行梯度洗脱，按先后顺序收集A1、A2和A3。A1峰产量为57．6毫克，电泳一条带。A2峰产量为160毫克，电泳二条带，用超纯水透析除盐后，超滤除热源，即可符合注射用蚓激酶的质量标准。A3峰产量为约319毫克，电泳三条带。
80毫克A2峰用0．02摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸，PH7．3的平衡液透析至平衡，进行Q-琼脂糖凝胶H．P层析柱分离，控制流速60毫升／小时，用0～0．2摩尔氯化钠进行梯度洗脱，按先后顺序收集分子量为25000±400、27000±400和29000±400的蚓激酶，电泳均为一条带。
144毫克A3峰用0．02摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸，PH7．3的平衡液透析至平衡，进行Q-琼脂糖凝胶H．P层析柱分离，控制流速12毫升／小时，用0～0．3摩尔氯化钠进行梯度洗脱，按先后顺序收集Q1、Q2、Q3和Q4。Q1峰为46．9毫克，电泳为一条带，分子量为30000±400。
各部分用3万超滤膜超滤，分别分离出分子量不同的蚓激酶原料药，加右旋糖酐10和注射用水至一定浓度，用0．22um微孔滤膜过滤，经分装和冻干制成粉针剂，均符合静脉注射用药的要求。
实施例3称取1．0公斤鲜活的锯齿远蚓用自来水洗净，加100克精盐并搅动后使蚯蚓吐出大量粘液，再用超纯水洗涤干净，加3．0升0．3摩尔磷酸缓冲液(PH8．3)，用胶体研磨粉碎，于4℃、6000转／分钟离心40分钟，取上清液置55℃水浴中加热1小时，再离心1次，上清液用0．45um微孔滤膜过滤得上清滤液1．2升，将上清滤液加入以精氨酸为配基的亲和层析柱进行亲和层析，控制流速30毫升／小时，待样品完全进入胶床后将胶面上部填满平衡缓冲液，洗脱至基线。用0．005～0．5摩尔／升精氨酸(PH8．8)进行梯度洗脱至基线，活性峰用0．02摩尔磷酸缓冲液(PH7．8)反复透析至PH7．8，即得总蚓激酶260毫克。
总蚓激酶进行羧甲基-琼脂糖凝胶柱层析，控制流速30毫升／小时，用0～1．5摩尔氯化钠进行梯度洗脱，按先后顺序收集C1、C2和C3。C1峰产量为约50毫克，电泳一条带。C2峰产量为约60毫克，电泳二条带。C3峰产量为138毫克，电泳三条带。
60毫克C2峰用0．02摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸，PH7．3的平衡液透析至平衡，进行Q-琼脂糖凝胶H．P层析柱分离，控制流速60毫升／小时，用0～0．2摩尔氯化钠进行梯度洗脱，按先后顺序收集分子量为23000±400的蚓激酶，电泳均为一条带。
各部分用5万超滤柱超滤制成分子量不同的蚓激酶原料药，加注射用水至一定浓度，分离出蚓激酶水溶液，用0．22um微孔滤膜过滤，分装成水针剂，均符合静脉注射的要求。
实施例4称取1．0公斤新鲜的广地龙用自来水洗净，加200克精盐并搅动后使蚯蚓吐出大量粘液，再用超纯水洗涤干净，加3．0升0．02摩尔三羟甲基氨基甲烷(PH8．8)，用胶体研磨粉碎，于4℃、10000转／分钟，离心30分钟，取上清液置50℃水浴中加热30分钟，再离心1次，上清液用0．45um微孔滤膜过滤得上清滤液1．2升，将上清滤液加入以慈菇蛋白酶抑制剂为配基的亲和层析柱，进行亲和层析，控制流速30毫升／小时，待样品完全进入胶床后，将胶面上部填满平衡缓冲液，洗脱至基线。用含1摩尔／升氯化钠和1．0摩尔精氨酸醋酸缓冲液(PH5．0)，洗脱活性峰至基线，活性峰用0．02摩尔磷酸缓冲液(PH7．8)反复透析，即得总蚓激酶280毫克。
总蚓激酶进行DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B柱层析，控制流速30毫升／小时，用0～1．0摩尔氯化钠进行梯度洗脱，按先后顺序收集A1、A2和A3。A1峰产量为30毫克，电泳一条带。A2峰产量为72毫克，电泳二条带。A3峰产量为160毫克，电泳三条带。
720毫克A2峰用0．02摩尔磷酸缓冲液(PH7．8)透析至平衡，进行葡聚糖凝胶-G75层析柱分离，控制流速12毫升／小时，用0．02摩尔磷酸缓冲液(PH7．8)进行洗脱，收集第一峰的前1／2处获得分子量为30000±400的蚓激酶，电泳为一条带。
各部分用5万超滤膜超滤，以下操作同实施例3，制成无菌无热源的蚓激酶水针剂。
权利要求
1．蚓激酶的分离工艺，其特征在于将新鲜的蚯蚓用水洗净，食盐处理，蚯蚓∶食盐按重量比为1∶0．02～0．2，洗净；加缓冲液，蚯蚓∶0．02～0．3摩尔三羟甲基氨基甲烷或磷酸缓冲液按W／V比为1∶1～3，PH7．3～8．8制成匀浆；6000～12000转／分钟，离心30～60分钟；上清液加热50～62℃，30～60分钟，沉淀杂蛋白后，再同法离心，得上清滤液；通过亲和层析收集总蚓激酶；分离用离子交换层析1；精制用分子筛层析或离子交换层析2，得分子量为30000±400，29000±400，28000±400，270004±400，25000±400和23000±400的蚓激酶；用超滤法除掉细菌内毒素后，分子量不同的蚓激酶原料药加辅料或注射用水，制成蚓激酶的粉针剂和水针剂。
2．根据权利要求1所述的分离工艺，其特征在于亲和层析的配基为精氨酸、苯甲脒、慈菇蛋白酶抑制剂和大豆胰蛋白酶抑制剂，洗脱液为0．005～1．0摩尔精氨酸，PH5．0～8．0和PH9．5～11．5的氨水。
3．根据权利要求1所述的分离工艺，其特征在于离子交换层析1采用羧甲基-或DEAE-葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶柱层析，用0～1．5摩尔氯化钠梯度洗脱分离出分子量不同的蚓激酶。
4．根据权利要求1所述的分离工艺，其特征在于分子筛层析采用葡聚糖凝胶-G75，离子交换层析2采用Mono-Q或Q-琼脂糖凝胶H．P层析，用0～1．5摩尔氯化钠缓冲液进行洗脱，制成分子量不同的蚓激酶溶液。
5．根据权利要求1所述的分离工艺，其特征在于超滤法采用3～5万的超滤膜或超滤柱进行超滤，制成分子量不同的蚓激酶原料药。
6．根据权利要求1所述的分离工艺，其特征在于新鲜活的蚯蚓是双胸蚓、赤子爱胜蚓、广地龙和锯齿远蚓。
全文摘要
本发明涉及注射用的蚓激酶的分离工艺,现有技术中的蚓激酶胶囊口服后,易在胃肠道破坏,吸收作用缓慢,不能发挥出溶解血栓的主要作用,本发明将给药途径改变为静脉注射,使蚓激酶的生物利用度和溶解血栓的作用得到充分的发挥,分离工艺详见说明书,本发明优点是高效,溶栓,抗凝,极低毒性,化学性质稳定,无热源,无过敏,原料来源丰富,经济,可制成粉针剂和水针剂,用于治疗心肌梗塞和脑梗塞,并适用于工业化生产规模。
文档编号A61K35/64GK1293245SQ0013271
公开日2001年5月2日 申请日期2000年11月14日 优先权日2000年11月14日
发明者孙启良 申请人:北京儒展生化药物研究中心