专利名称：一种蚓激酶干粉制作工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种蚓激酶干粉制作工艺。
背景技术：
蚓激酶是一种从蚯蚓体内提取分离而得的一组蛋白水解酶类，其主要成分为纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原激活剂，这两种成分通过直接降解纤维蛋白原和激活纤溶酶的双重作用，能够降低纤维蛋白原含量和血小板的聚集率，增强纤溶系统活性，纠正脑梗死后的凝血和纤溶异常，对治疗心绞痛、急性脑梗、高血脂、高血压等疾病，减轻患者病痛都具有良好的疗效。蚓激酶是目前最有开发前景的纤溶药物之一，无论静脉注射还是口服给药，溶栓效果都很明显。目前，制作蚓激酶干粉首先需要提取蚓激酶，常用的提取蚓激酶的方法有盐析，继而采用多种层析及HPLC、FPLC、亲和层析、或离子交换、分子筛、凝胶电泳等手段从不同品系的蚯蚓中获得多种蚓激酶，但此类提取方法操作麻烦，流程长，对酶活力的损失也较大，提取的蚓激酶质量标准低，这些特点限制了蚓激酶干粉的工业化生产，不能很好的满足我国重大疾病防治和医药产业发展的需求。
发明内容
本发明为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种有效成分含量高、质量易控、且利于工业化生产的蚓激酶干粉制作工艺。本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是:
一种蚓激酶干粉制作工艺，其特征在于包括以下步骤:
1)鲜蚓处理:在地面或筐中将蚯蚓体表面的泥土层层除去，然后将蚯蚓铺成薄层，光照射10-18h，使蚯蚓排出污物，再利用清洗机清洗蚯蚓表面的泥和粘浮物，塑料桶盛装经上述处理的蚯蚓，然后放入冷库中贮存备用；
2)制浆:加入蚯蚓体积3-5倍的浓度为0.lmol/L的乙醇柠檬酸钠缓冲液，利用胶体磨或高速组织均质机将清理过的蚯蚓进行细胞破碎，制成匀浆；
3)除渣:将经步骤2)制得的匀浆经离心机离心去除粗渣，收集上清液；
4)盐析:向经步骤3)处理收集的上清液中加入硫酸铵，利用搅拌机搅拌至完全溶解，使制得的饱和溶液中硫酸铵的质量分数为30%-40%，然后静止放置1-1.5h，制得饱和溶液；
5)离心:利用高速离心机离心分离经步骤4)制得的饱和溶液，去除其中含有的细渣，得到澄清液；
6)超滤:取经步骤5)处理得到的澄清液，采用50000dt的超滤膜超滤，得超滤液；
7)柱层析分离:用泵将超滤液输送到下料桶，然后混合上样，待上样完毕，利用洗涤液洗涤流出液呈淡黄色，PH为7.0-8.0,呈碱性之后，再用 弱碱性液洗脱至洗脱液变浑浊，颜色由黄变红，流出液电导率高于洗脱液电导率时开始收集流出液，当流出液开始变澄清，颜色呈淡橙色，电导率达到洗脱液电导率时停止洗脱，得收集液；8)浓缩和二次超滤:将经步骤7)得到的收集液倒入贮存罐内，开启浓缩泵，调节转速为21X12rpm，调节压力小于等于0.1Mpa，浓缩至收集液体积为原来的1/14-1/15，收集浓缩液按步骤6)进行超滤，超滤至澄清后上洗脱柱用去离子水脱盐，最后洗脱至浓缩液pH为7.0，体积为收集液体积的1/16-1/20时止，得浓缩液；
9)过滤和除菌:用澄清型和除菌型液净滤板过滤步骤8)制得的浓缩液2-3遍，至滤液澄清，然后用0.22 μ m的微孔滤膜对滤液进行过滤灭菌，得料液成品；
10)喷干:利用干燥塔，控制干燥塔出口温度为80-86°C，干燥经上述步骤处理得到的料液成品，收集干燥后制得的蚓激酶干粉。所述步骤2)的乙醇柠檬酸钠缓冲液的pH7.0-8.0。所述步骤7)的收集液电导率大于或等于9000 μ s/ Cm。
本发明的有益效果为:本发明与现有技术相比，优点在于本发明采用多次超滤和微孔过滤，能有效去除悬浮颗粒和小分子杂蛋白、核酸，杂菌等杂质，提高蚓激酶的纯度，进而获得纯度高、活性好的蚓激酶干粉；另外，整个制作过程各个环节相互紧凑，有效提高了中间介质的纯度和处理液的工作能力，且原料来源丰富、价格低廉，适合工业化生产。
具体实施例方式为能进一步了解本发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例详细说明如下: 实施例1:取IOOKg鲜蚯蚓，在地面将蚯蚓体表面的泥土层层除去，然后将蚯蚓铺成薄
层，光照射10h，使蚯蚓排出污物，再利用清洗机清洗蚯蚓表面的泥和粘浮物，塑料桶盛装经上述处理的蚯蚓，然后放入冷库中贮存备用；加入蚯蚓体积3倍的浓度为0.lmol/L, pH为
7.8的乙醇柠檬酸钠缓冲液，利用胶体磨或高速组织均质机将清理过的蚯蚓进行细胞破碎，制成匀浆；将制得的匀浆经离心机离心去除粗渣，收集上清液；向上清液中加入硫酸铵，利用搅拌机搅拌至完全溶解，使制得的饱和溶液中硫酸铵的质量分数为30%，然后静止放置
1.0h，制得饱和溶液；利用高速离心机离心分离饱和溶液，去除其中含有的细渣，得到澄清液；采用50000dt的超滤膜超滤澄清液，得超滤液；用泵将超滤液输送到下料桶，然后混合上样，待上样完毕，利用洗涤液洗涤流出液呈淡黄色，PH为7.0，呈碱性之后，再用弱碱性液NH3H2O洗脱至洗脱液变浑浊，颜色由黄变红，流出液电导率高于洗脱液电导率时开始收集流出液，当流出液开始变澄清，颜色呈淡橙色，电导率达到洗脱液电导率时停止洗脱，得收集液；将收集液倒入贮存罐内，开启浓缩泵，调节转速为21X12rpm，调节压力为0.1Mpa，浓缩至收集液体积为原来的1/14，收集浓缩液再进行超滤，超滤至澄清后上洗脱柱用去离子水脱盐，最后洗脱至浓缩液PH为7.0，体积为收集液体积的1/16时止，得浓缩液；用澄清型和除菌型液净滤板将浓缩液过滤2遍，至滤液澄清，然后用0.22 μ m的微孔滤膜对滤液进行过滤灭菌，得料液成品；最后，利用干燥塔，控制干燥塔出口温度为80°C，干燥经上述步骤处理得到的料液成品，收集干燥后制得的蚓激酶干粉。所述用的乙醇柠檬酸钠缓冲液的ρΗ5.0,收集液电导率大于或等于9000 μ s/ Cm。实施例2 -M IOOKg鲜蚯蚓，在地面将蚯蚓体表面的泥土层层除去，然后将蚯蚓铺成薄层，光照射15h，使蚯蚓排出污物，再利用清洗机清洗蚯蚓表面的泥和粘浮物，塑料桶盛装经上述处理的蚯蚓，然后放入冷库中贮存备用；加入蚯蚓体积4倍的浓度为0.1mol/L, pH为7.8的乙醇柠檬酸钠缓冲液，利用胶体磨或高速组织均质机将清理过的蚯蚓进行细胞破碎，制成匀浆；将制得的匀浆经离心机离心去除粗渣，收集上清液；向上清液中加入硫酸铵，利用搅拌机搅拌至完全溶解，使制得的饱和溶液中硫酸铵的质量分数为35%，然后静止放置1.3h，制得饱和溶液；利用高速离心机离心分离饱和溶液，去除其中含有的细渣，得到澄清液；采用50000dt的超滤膜超滤澄清液，得超滤液；用泵将超滤液输送到下料桶，然后混合上样，待上样完毕，利用洗涤液洗涤流出液呈淡黄色，PH为7.5，呈碱性之后，再用弱碱性液三乙胺洗脱至洗脱液变浑浊，颜色由黄变红，流出液电导率高于洗脱液电导率时开始收集流出液，当流出液开始变澄清，颜色呈淡橙色，电导率达到洗脱液电导率时停止洗脱，得收集液；将收集液倒入贮存罐内，开启浓缩泵，调节转速为21 X 12rpm，调节压力为
0.0SMpa,浓缩至收集液体积为原来的1/14，收集浓缩液再进行超滤，超滤至澄清后上洗脱柱用去离子水脱盐，最后洗脱至浓缩液PH为7.0，体积为收集液体积的1/18时止，得浓缩液；用澄清型和除菌型液净滤板将浓缩液过滤3遍，至滤液澄清，然后用0.22 μ m的微孔滤膜对滤液进行过滤灭菌，得料液成品；最后，利用干燥塔，控制干燥塔出口温度为83°C，干燥经上述步骤处理得到的料液成品，收集干燥后制得的蚓激酶干粉。所述用的乙醇柠檬酸钠缓冲液的PH5.2，收集液电导率大于或等于9000 μ s/ Cm。实施例3:取IOOKg鲜蚯蚓，在地面将蚯蚓体表面的泥土层层除去，然后将蚯蚓铺成薄层，光照射18h，使蚯蚓排出污物，再利用清洗机清洗蚯蚓表面的泥和粘浮物，塑料桶盛装经上述处理的蚯蚓，然后放入冷库中贮存备用；加入蚯蚓体积5倍的浓度为0.lmol/L,pH为7.8的乙醇柠檬酸钠缓冲液，利用胶体磨或高速组织均质机将清理过的蚯蚓进行细胞破碎，制成匀浆；将制得的匀浆经离心机离心去除粗渣，收集上清液；向上清液中加入硫酸铵，利用搅拌机搅拌至完全溶解，使制得的饱和溶液中硫酸铵的质量分数为40%，然后静止放置1.5h，制得饱和溶液；利用高速离心机离心分离饱和溶液，去除其中含有的细渣，得到澄清液；采用50000dt的超滤膜超滤澄清液，得 超滤液；用泵将超滤液输送到下料桶，然后混合上样，待上样完毕，利用洗涤液洗涤流出液呈淡黄色，pH为8.0，呈碱性之后，再用弱碱性液洗脱至洗脱液变浑浊，颜色由黄变红，流出液电导率高于洗脱液电导率时开始收集流出液，当流出液开始变澄清，颜色呈淡橙色，电导率达到洗脱液电导率时停止洗脱，得收集液；将收集液倒入贮存罐内，开启浓缩泵，调节转速为21X12rpm，调节压力为0.09Mpa，浓缩至收集液体积为原来的1/15，收集浓缩液再进行超滤，超滤至澄清后上洗脱柱用去离子水脱盐，最后洗脱至浓缩液PH为7.0，体积为收集液体积的1/20时止，得浓缩液；用澄清型和除菌型液净滤板将浓缩液过滤3遍，至滤液澄清，然后用0.22 μ m的微孔滤膜对滤液进行过滤灭菌，得料液成品；最后，利用干燥塔，控制干燥塔出口温度为86°C，干燥经上述步骤处理得到的料液成品，收集干燥后制得的蚓激酶干粉。所述用的乙醇柠檬酸钠缓冲液的ρΗ5.3，收集液电导率大于或等于9000 μ s/ Cm。以上对本发明的具体实施方式
进行详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施方式，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
权利要求
1.一种蚓激酶干粉制作工艺，其特征在于包括以下步骤: 1)鲜蚓处理:在地面或筐中将蚯蚓体表面的泥土层层除去，然后将蚯蚓铺成薄层，光照射10-18h，使蚯蚓排出污物，再利用清洗机清洗蚯蚓表面的泥和粘浮物，塑料桶盛装经上述处理的蚯蚓，然后放入冷库中贮存备用； 2)制浆:加入蚯蚓体积3-5倍的浓度为0.lmol/L的乙醇柠檬酸钠缓冲液，利用胶体磨或高速组织均质机将清理过的蚯蚓进行细胞破碎，制成匀浆； 3)除渣:将经步骤2)制得的匀浆经离心机离心去除粗渣，收集上清液； 4)盐析:向经步骤3)处理收集的上清液中加入硫酸铵，利用搅拌机搅拌至完全溶解，使制得的饱和溶液中硫酸铵的质量分数为30%-40%，然后静止放置1-1.5h，制得饱和溶液； 5)离心:利用高速离心机离心分离经步骤4)制得的饱和溶液，去除其中含有的细渣，得到澄清液； 6)超滤:取经步骤5)处理得到的澄清液，采用50000dt的超滤膜超滤，得超滤液； 7)柱层析分离:用泵将超滤液输送到下料桶，然后混合上样，待上样完毕，利用洗涤液洗涤流出液呈淡黄色，PH为7.0-8.0，呈碱性之后，再用弱碱性液洗脱至洗脱液变浑浊，颜色由黄变红，流出液电导率高于洗脱液电导率时开始收集流出液，当流出液开始变澄清，颜色呈淡橙色，电导率达到洗脱液电导率时停止洗脱，得收集液； 8)浓缩和二次超滤:将经步骤7)得到的收集液倒入贮存罐内，开启浓缩泵，调节转速为21X12rpm，调节压力小于等于0.1Mpa，浓缩至收集液体积为原来的1/14-1/15，收集浓缩液按步骤6)进行超滤，超滤至澄清后上洗脱柱用去离子水脱盐，最后洗脱至浓缩液pH为7.0，体积为收集液 体积的1/16-1/20时止，得浓缩液； 9)过滤和除菌:用澄清型和除菌型液净滤板过滤步骤8)制得的浓缩液2-3遍，至滤液澄清，然后用0.22 μ m的微孔滤膜对滤液进行过滤灭菌，得料液成品； 10)喷干:利用干燥塔，控制干燥塔出口温度为80-86°C，干燥经上述步骤处理得到的料液成品，收集干燥后制得的蚓激酶干粉。
2.如权利要求1所述的一种蚓激酶干粉制作工艺，其特征在于所述步骤2)的乙醇柠檬酸钠缓冲液的PH7.0-8.0。
3.如权利要求1所述的一种蚓激酶干粉制作工艺，其特征在于所述步骤7)的收集液电导率大于或等于9000 μ s/ Cm。
全文摘要
本发明提供一种蚓激酶干粉制作工艺，其特征在于包括以下步骤鲜蚓处理、制浆、除渣、盐析、离心、超滤、柱层析分离、浓缩和二次超滤、过滤和除菌，最后喷干制得的蚓激酶干粉。本发明与现有技术相比，优点在于本发明采用多次超滤和微孔过滤，能有效去除悬浮颗粒和小分子杂蛋白、核酸，杂菌等杂质，提高蚓激酶的纯度，进而获得纯度高、活性好的蚓激酶干粉；另外，整个制作过程各个环节相互紧凑，有效提高了中间介质的纯度和处理液的工作能力，且原料来源丰富、价格低廉，适合工业化生产。
文档编号C12N9/48GK103146668SQ201310063359
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月28日 优先权日2013年2月28日
发明者蔡霞 申请人:天津市嘉沃科技有限公司