吐泥后蚯蚓进行称重，吐净泥沙后的蚯蚓采用组织匀浆机分别制备得到含有蚯蚓体腔液的混合液和剩余皮渣；将含有蚯蚓体腔液的混合液高速离心分别得到蚯蚓体腔液和体腔液中的沉淀部分；所述剩余皮渣和所述体腔液中的沉淀部分进行细胞粉碎，粉碎后的产物和所述的蚯蚓体腔液再次混合和离心，离心取上清液。
[0038]第二步，硫酸铵沉淀法纯化蛋白组分:对上清液利用30%硫酸铵沉淀法进行盐析，在上清液中滴加5d 10% EDTA-Na2溶液，以减少硫酸钱溶液中残留的重金属离子造成蛋白质变性的可能性，配置饱和硫酸铵溶液，边搅拌边徐徐加入饱和硫酸铵，按2体积上清液加入I体积饱和硫酸铵溶液，沉淀蛋白质，去除无机组分和核酸成分。0°C磁力搅拌12h后，进行10000r/min超低温离心15min,去上清，取沉淀。
[0039]第三步，透析去盐:将沉淀加入0.2mol/L pH = 7.6的PBs缓冲液摇匀，至眼观无沉淀物质后，灌入27mm(MD34)透析袋(Mff: 12000-14000)，将透析带置于pH = 7.6的PBs缓冲液中。对透析后产物进行lOOOOr/min超低温离心15min，取上清液，即为蚯蚓蛋白粗提物。
[0040]第四步，CM Sephadex C-50阳离子交换层析:
[0041]I)层析柱预处理:选用40*700mm层析柱，层析柱用高锰酸钾清洗，再用二甲基二氯硅烷处理管壁，降低“管壁效应”。
[0042]2)凝胶填料制备:按照 Ig CM Sephadex C-50 干粉加入 30ml 0.2mol/L pH = 7.6的PBS缓冲液的比例，放入缓冲液中浸泡使之膨胀，在100°C沸水浴中使之浸泡约2h，同时用玻璃棒轻轻搅动，使凝胶颗粒混匀。凝胶膨胀后有一些凝胶颗粒悬浮在溶液中，倾倒掉上层溶液以去除这些凝胶颗粒，反复进行，直至除尽悬浮凝胶颗粒。
[0043]3)装柱:层析柱固定在铁架台上，在铁架台上悬一细绳作为参照，使层析柱保持与地面垂直，封闭层析柱下端，沿管壁缓缓倒入少许缓冲液，再将凝胶溶液一边用玻璃棒搅动一边缓缓连续加入柱内，至柱高75% — 80%左右，利用缓冲液冲洗层析柱末端，以排除凝胶柱中死角内的空气，确保凝胶柱中无气体介质。立即用缓冲剂填满层析柱中剩余区域，并将层析柱顶端与动力栗相连，打开层析柱底端出水口，用缓冲液平衡层析柱内环境，使其性质稳定。
[0044]4)加样及梯度式洗脱:从层析柱顶端用移液枪缓缓加入5ml蚯蚓蛋白粗提物，用NaCl (0.Ι-lmol/L)进行阶段性梯度洗脱，流速0.3ml/min，自动部分收集齐收集洗脱液，1min/管，利用紫外核酸蛋白仪测定洗脱液280nm波长处的光吸收度值(A2ifflnni)，根据A280nni的大小绘制洗脱曲线，整个分离过程均在4°C环境中进行。
[0045]艇顿粗提物经过CM-Sephadex C_50阳离子交换层析，分离得到5个蛋白峰，分别标记为ACAE-A?E，蛋白回收率为57%，洗脱液总体积为1270mL，收集时间为175h，层析色谱见图1。经鉴定有溶解血栓功效的为ACAE-C、ACAE-D
[0046]第五步，Sephadex G-75凝胶过滤层析:
[0047]I)层析柱预处理:选用24*900mm层析柱，层析柱用高锰酸钾清洗，再用二甲基二氯硅烷处理管壁，降低“管壁效应”。
[0048]2)凝胶填料制备:按照 Ig Sephadex G-75 干粉加入 20ml 0.2mol/L pH = 7.6 的PBs的比例，放入缓冲液中浸泡使之膨胀，在100°C沸水浴中使之浸泡约2h，同时用玻璃棒轻轻搅动，使凝胶颗粒混匀。凝胶膨胀后有一些凝胶颗粒悬浮在溶液中，倾倒掉上层溶液以去除这些凝胶颗粒，反复进行，直至液相不再混浊为止。
[0049]3)装柱:将层析柱垂直安置在无直接光照、无空气对流处，防止层析柱内产生气泡，取3/4体积的凝胶和1/4体积的pH = 7.6的0.01mol/L PBs缓冲液制成凝胶浆。沿柱子一侧倾入凝胶浆，一次性完成，确保柱床均一。按凝胶体积加入2倍体积缓冲液。
[0050]4)样品上柱及洗脱:加入5ml CM-Sephadex C_50阳离子交换层析经鉴定具有活性的组分ACAE-C和ACAE-D，利用Sephadex G-75凝胶过滤层析进行脱盐和进一步纯化。样品上样后，用双蒸水洗脱，流速为1.8ml/min，部分收集器收集洗脱液，1min/管，利用紫外核酸蛋白仪测定洗脱液280nm波长处的光吸收度值(Α.ηηι)，根据Α.ηηι的大小绘制洗脱曲线。
[0051]选择有溶解血栓功效的ACAE-C、ACAE-D，用Sephadex G_75凝胶过滤层析进行纯化，使等电点相近、分子量不同的其他蛋白质的物质分离，并去除收集组分中所含的盐类物质。分离得到4个蛋白峰，分别标记为ACAE-Cl、ACAE-C2、ACAE-D1、ACAE-D2，ACAE-C和ACAE-D的Sephadex G-75凝胶过滤层析色谱见图2和图3。
[0052]用SDS-PAGE对样品凝胶以确定样品的分子量。根据Maker在凝胶上的位置，利用B1sens SC805凝胶成像系统计算得出ACAE-Cl分子量约为28.3kD，ACAE-C2分子量约为29.6kD，ACAE-Dl分子量约为26.4-32.3kD之间，ACAE-D2分子量约为26.0-31.8kD之间，电泳图见图4。
【主权项】
1.一种蚯蚓中蚓激酶的纯化方法，其特征在于:该方法包括如下步骤: 第一步，蚯蚓组织匀浆制备:吐净泥沙后的蚯蚓采用组织匀浆机分别制备得到含有蚯蚓体腔液的混合液和剩余皮渣；将含有蚯蚓体腔液的混合液高速离心分别得到蚯蚓体腔液和体腔液中的沉淀部分；所述剩余皮渣和所述体腔液中的沉淀部分进行细胞粉碎，粉碎后的产物和所述的蚯蚓体腔液再次混合和离心，离心取上清液； 第二步，硫酸铵沉淀法纯化蛋白组分:在所述的上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，加入完毕后搅拌8?15h，搅拌后离心，取沉淀； 第三步，透析去盐:在第二步中的沉淀中加入PBS缓冲液并摇匀至无沉淀，得到混合液；将该混合液灌入透析袋，并将透析袋置于PBS缓冲液中，对透析后产物进行离心，离心后取上清液即为蚯蚓蛋白粗提物； 第四步，CM Sephadex C-50阳离子交换层析:选用尺寸为40*700mm、预处理过的层析柱，在该层析柱中装入凝胶填料，装入填料后在层析柱顶端缓慢加入所述的蚯蚓蛋白粗提物，并用NaCl进行阶段性梯度洗脱，流速为0.15?0.45ml/min，收集洗脱液；对洗脱液进行鉴定，选取具备溶解血栓功效的洗脱液，待用； 该步骤中凝胶填料的制备方法为:按Ig CM Sephadex C-50干粉加入30ml、0.2mol/L、pH = 7.6的PBS缓冲液的比例进行配置，配置后在沸水浴中浸泡的同时缓慢搅动，使组分混匀； 第五步，Sephadex G-75凝胶过滤层析:选用尺寸为24*900mm、预处理过的层析柱，在该层析柱中装入凝胶填料，装入填料后，将第四步待用的洗脱液在层析柱顶端缓慢加入，并用蒸馈水进行洗脱，流速为I?2.5ml/min，收集洗脱液； 该步骤中凝胶填料的制备方法为:按Ig Sephadex G-75干粉加入20ml、0.2mol/L、pH=7.6的PBS缓冲液的比例进行配置，配置后在沸水浴中浸泡的同时缓慢搅动，使组分混匀。2.根据权利要求1所述的蚯蚓中蚓激酶的纯化方法，其特征在于:第二步中，上清液与饱和酸钱溶液的体积为I?3:1。3.根据权利要求1所述的蚯蚓中蚓激酶的纯化方法，其特征在于:第三步中，所述的PBS缓冲液的pH = 7.6，浓度为0.2mol/L04.根据权利要求1所述的蚯蚓中蚓激酶的纯化方法，其特征在于:第四步和第五步中，层析柱预处理均是依次用高锰酸钾和二甲基二氯硅烷处理管壁。5.根据权利要求1所述的蚯蚓中蚓激酶的纯化方法，其特征在于:第四步中，蚯蚓蛋白粗提物的加入量为4?6mL。6.根据权利要求1所述的蚯蚓中蚓激酶的纯化方法，其特征在于:第四步的整个操作过程均在温度为4°C的条件下进行。7.根据权利要求1所述的蚯蚓中蚓激酶的纯化方法，其特征在于:该纯化方法还包括分子量测定，所述分子量测定是采用凝胶成像法。8.根据权利要求1所述的蚯蚓中蚓激酶的纯化方法，其特征在于:第一步中所述的蚯蚓为大平2号。
【专利摘要】本发明公开了一种蚯蚓中蚓激酶的纯化方法，该方法采用阳离子交换层析法和凝胶过滤层析法从蚯蚓的匀浆液中分离纯化一种具有纤溶活性的纤溶酶,离子交换层析过程中采用CM？Sephadex？C-5作为填料，PBS作为配基，NaCl作为洗脱液。该组分经过SDS-PAGE检测为混合成分。实验结果表明它具有较高的纤溶蛋白酶活性。此方法简洁方便，成本低，适用于规模化生产。
【IPC分类】C12N9/68
【公开号】CN105132398
【申请号】CN201510512629
【发明人】王飞, 刘力萍, 高倩, 绳则翠, 陈国萍, 邢光才
【申请人】江苏中邦制药有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月19日