用于制造化合物的组合物和方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2009年12月22日、申请号为200980157048. 0、发明名称为"用 于制造化合物的组合物和方法"的发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本申请涉及用于制造化合物的组合物和方法。
[0003] 相关申请案的夺叉参考
[0004] 本申请案主张2008年12月22日申请的美国临时申请案第61/140, 053号的权益， 该案完整内容以引用的方式并入本文中。
【背景技术】
[0005] 尽管工业发酵取得了进步，而且生物技术也得到了发展，但当前的方法仍不允许 大规模（工业或商业规模）批量制造某些化合物。举例来说，例如在制造生物燃料的过程 中产生的大多数直链和芳香族烃是细胞生长的强抑制剂。因此，生物化学合成局限于天然 产物（例如，维生素、酶、抗体）以及高价值、小体积的合成物。尽管如此，无法通过工业发 酵制造的含碳中性合成产品和细胞毒性产品仍存在较大市场。因此，需要能够大规模制造 难以合成的化合物，包括例如杀生物剂、抗生素和抗癌化合物等有治疗益处的化合物的替 代性制造方法。
[0006]疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC)预 计，每年有介于5%与20%之间的美国人将发生流感。根据⑶C，约200, 000人将因流感并 发症而住院治疗，且多达36, 000人会因患病而死亡。患流感风险最高的人是老年人、儿童 以及具有慢性健康状况的人。通常感染鸟类（包括家禽）的禽流感引起了更多且更特殊的 问题。由于这些病毒一般不感染人类，使得人们只有极少的针对这些病毒的免疫防护或没 有免疫防护。在2003年末和2004年初期间亚洲的家禽爆发禽流感（即，A型流感（H5N1) 病毒）后，世卫组织（World Health Organization)报导自2004年1月起有超过130例人 感染病例，且迄今已有70人因感染禽流感而死亡。
[0007] 奥司他韦（Oseltamivir)是一种用于治疗和预防A型流感和B型流感的神经氨酸 酶抑制剂，且普遍认为其最适用于治疗禽流感。磷酸奥司他韦，作为首个商业开发的口服 活性神经氨酸酶抑制剂，是由吉利德科技公司（Gilead Sciences)所开发，并且目前由霍 夫曼?罗氏公司（Hoffman-La Roche，Roche)以商品名TAMIFLU上市销售。作为流感病毒 复制必需的神经氨酸酶的抑制剂，TAMIFLU对H5N1和H7N7病毒株有效。在2005年东南亚 H5N1禽流感大爆发期间，TAMIFLU得到广泛使用。然而，预计目前TAMIFLU的供应仅覆盖世 界2 %的人口。TAMIFLU制造中的主要瓶颈是莽草酸的利用率，莽草酸是一种源自植物的天 然存在的化合物。尽管已知用于合成莽草酸的化学反应，但目前合成莽草酸的方法涉及可 能发生爆炸的叠氮化（azide chemistry)，而且很难在商业规模上大量合成莽草酸。
[0008] 全世界的中央政府和医学界都已经认识到，为应对可能发生的全球大规模流行 病，迫切需要大规模制造和储存治疗剂，例如TAMIFLU。举例来说，尽管针对流感的疗法取得 了进步，但当前用于治疗流感的方法不足以应对全球或甚至国家范围的紧急事件。因此，迫 切需要制造适用于治疗感染性疾病的化合物。
【发明内容】
[0009] 如下文所述，本发明提供用于制造相关化合物（例如有治疗作用的化合物或其前 体）的组合物和系统。
[0010] -方面，本发明提供一种分离的组合物，其含有催化形成化合物的酶和三磷酸腺 苷（adenosine triphosphate，ATP)再生系统，其中所述酶和所述ATP再生系统是从相同来 源或独立来源获得，且其中至少一种来源是无细胞提取物。
[0011] 另一方面，本发明提供一种用于合成化合物的体外无细胞系统，所述系统含有碳 源、磷酸盐源、水、催化形成化合物的酶、能源、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP) 和三磷酸腺苷（ATP)再生系统。
[0012] 另一方面，本发明提供一种用于合成化合物的方法，所述方法涉及提供包括碳源、 磷酸盐源、水、催化形成化合物的酶、能源、二磷酸腺苷（ADP)和三磷酸腺苷（ATP)再生系统 的组分，以形成体外无细胞反应物；以及培育所述体外无细胞反应物以合成所述化合物。
[0013] 又一方面，本发明提供一种用于合成莽草酸的方法，所述方法涉及提供包括莽草 酸前体、ATP源和催化形成莽草酸的酶的组分，以形成体外无细胞反应物；以及培育所述体 外无细胞反应物，由此合成莽草酸。
[0014] 另一方面，本发明提供一种分离的组合物，其包含选自由3-脱氧-D-阿拉伯-庚 酮糖酸（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate，DAHP)合成酶、脱氢奎尼酸合成酶、脱氢奎尼 酸脱水酶、脱氢莽草酸脱氢酶或其组合组成的群组的酶，以及三磷酸腺苷ATP再生系统，其 中所述酶和所述ATP再生系统是从相同来源或独立来源获得，其中至少一种来源是无细胞 提取物。
[0015] 另一方面，本发明提供一种用于合成化合物的体外无细胞系统，其含有碳源、磷 酸盐源、水、能源、二磷酸腺苷（ADP)、光合三磷酸腺苷（ATP)再生系统，以及包括3-脱 氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸（DAHP)合成酶、脱氢奎尼酸合成酶、脱氢奎尼酸脱水酶、脱氢莽草 酸脱氢酶或其组合的酶。
[0016] 另一方面，本发明提供一种用于合成化合物的方法，所述方法涉及提供包括碳源、 磷酸盐源、水、二磷酸腺苷（ADP)、三磷酸腺苷（ATP)再生系统以及选自由3-脱氧-D-阿拉 伯-庚酮糖酸（DAHP)合成酶、脱氢奎尼酸合成酶、脱氢奎尼酸脱水酶、脱氢莽草酸脱氢酶或 其组合组成的群组的酶的组分，以形成体外无细胞反应物；以及培育所述体外无细胞反应 物，以合成所述化合物。
[0017] 在任一上述方面的各种实施例中，酶和ATP再生系统是从独立来源获得。所述来 源可独立选自无细胞提取物、体外反应物或其组合。在任一上述方面的各种实施例中，体 外无细胞系统进一步包括体外合成的化合物（例如，在各种实施例中，莽草酸是体外合成 的）。在任一上述方面的各种实施例中，ATP再生系统是光合ATP再生系统。在任一上述方 面的各种实施例中，ATP再生系统是从植物、藻类或蓝藻细菌分离。在任一上述方面的各种 实施例中，ATP再生系统含有类囊体膜。在任一上述方面的各种实施例中，ATP再生系统含 有叶绿体。
[0018] 在任一上述方面的各种实施例中，ATP再生系统含有ATP合成酶、细胞色素b 6_f复 合物、质体蓝素和光系统1 (photosystem 1，PS1)复合物。在特定实施例中，PS1复合物包 含多肽PsaA至PsaS，以及分子叶绿素700、叶绿醌、Fe4S 4和类胡萝卜素；且细胞色素1364复 合物包含细胞色素b6、细胞色素f、铁-硫蛋白、细胞色素b 6_f亚基IV，以及分子血红素W、 血红素bH、血红素c和Fe2S 2。
[0019] 在任一上述方面的各种实施例中，ATP再生系统含有光系统2(PS2)复合物和质体 醌。在任一上述方面的各种实施例中，ATP再生系统包含ATP合成酶、光系统2 (PS2)复合物、 质体醌和细胞色素b6-f复合物。在特定实施例中，PS2复合物包含多肽Cp43、Cp47、PsbO、 PsbP、PsbQ、PsbE、PsbF、猛稳定蛋白，以及分子叶绿素680、脱镁叶绿素（pheophytin)、醌、 0胡萝卜素和血红素b559。
[0020] 在任一上述方面的各种实施例中，酶是从溶解产物获得或通过体外翻译合成的多 肽。在任一上述方面的各种实施例中，化合物是治疗性化合物、治疗性化合物的前体或染 料。在特定实施例中，治疗性化合物是用于治疗流感。在特定实施例中，化合物是莽草酸 或莽草酸前体。在任一上述方面的各种实施例中，分离的组合物含有酶3-脱氧-D-阿拉 伯-庚酮糖酸（DAHP)合成酶、脱氢奎尼酸合成酶、脱氢奎尼酸脱水酶、脱氢莽草酸脱氢酶或 其组合。
[0021 ] 在各种实施例中，体外无细胞系统进一步含有蛋白酶抑制剂、氨基酸、核糖体、编 码催化形成化合物的酶的氨基酸序列的RNA、RNA聚合酶、编码催化形成化合物的酶的核苷 酸序列的DNA，或其组合。
[0022] 在各种实施例中，碳源是化合物的前体。在各种实施例中，各组分是在一个以上步 骤中添加。在各种实施例中，所述方法进一步包含纯化合成的化合物的步骤。
[0023] 在各种实施例中，莽草酸的前体是磷酸稀醇丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP)、 4_磷酸赤藓糖（erythrose 4-phosphate，E4P)、3_脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸（DAHP)、脱 氢奎尼酸、脱氢莽草酸，或其组合。
[0024] 在各种实施例中，体外无细胞反应进一步涉及提供包括蛋白酶抑制剂、氨基酸、核 糖体、编码催化形成化合物的酶的氨基酸序列的RNA、RNA聚合酶、编码催化形成化合物的 酶的核苷酸序列的DNA或其组合的组分。
[0025] 在各种实施例中，ATP再生系统或体外无细胞系统含有丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK)。在各种实施例中，ATP再生系统或体外无细胞系统进一步含有磷酸葡萄糖 异构酶、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PKK-1)、二磷酸果糖醛缩酶（frustose bisphosphate aldolase)、磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase，TPI)、磷酸 甘油酸脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GADPH)、磷酸甘油酸激 酶（phosphoglycerate kinase，PGK)、磷酸甘油酸变位酶（phosphoglycerate mutase， PGM)和烯醇酶。在各种实施例中，ATP再生系统或体外无细胞系统进一步含有己糖激酶 (hexokinase，HK)。在各种实施例中，能源包括葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、磷酸稀醇丙酮酸或 其组合。
[0026] 本发明的其它特征和益处将从以下实施方式和权利要求书显而易见。
【附图说明】
[0027]图1是描绘用于制造化合物的系统的示意图，在所述系统中，ATP再生系统与合成 相关化合物的酶途径的组分相结合。
[0028] 图2是描绘光合途径以及产生三磷酸腺苷（ATP)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酉爱（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的不意图。
[0029]图3是描绘莽草酸生物合成途径的示意图。
[0030] 图4是描绘用于制造莽草酸的系统的示意图，其中涉及由光合ATP再生系统产生 的 ATP