专利名称：应用真菌诱导龙血树产生血竭的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及一种利用真菌诱导龙血树产生血竭
的方法。
背景技术：
血竭(dragon' s blood)是一种深红色树脂，自古代已作为著名的传统药材用于 许多国家。在临床上主要用于促进血液循环，治疗创伤、炎症、痢疾和糖尿病。据文献报 道，目前市场上的血竭主要来源于4科5属23种植物。在中国，上世纪70年代，蔡希陶先 生在云南省发现了剑叶龙血树[Dracaena cochinchinensis (Lour.) S. C. Chen]的红色树 脂可替代进口血竭使用，彻底改变了血竭长期进口的历史。后续又在海南省发现了国产龙 血竭(Chinesedragon， s blood)的另一基源植物小花龙血树(D. c咖bodi, Pierre ex Gagn印.)。 近年来，对国产血竭的需求量剧增，使得剑叶龙血树和小花龙血树野生资源的蕴 藏量急剧下降，已被列为国家珍稀濒危保护植物。使得血竭的开发利用受到限制，因此广辟 生产途径，解决血竭资源贫乏问题变得十分迫切。 目前研究表明血竭的形成与树体的损伤及镰刀菌属真菌的侵染有密切的关系。由 此可见，真菌在血竭的产生过程中有举足轻重的作用。在自然环境条件下，血竭的产量不仅 低，而且生产周期长。因此，人为的接种特定微生物有望提高血竭的产量，并大幅度縮短产 生血竭的时间，也许是最有应用前景的途径之一 。
发明内容
本发明的目的在于提供1株能够诱导龙血树产生血竭的真菌，该真菌是从龙血树 的茎部分离得到的，它能促进活体龙血树树干和离体龙血树树干产生与血竭化学成分相似 的红色物质。 本发明的又一 目的在于提供一种应用真菌诱导龙血树产生血竭的方法，该方法工 艺简单，生产成本低廉，生产周期短，充分地利用和保护了龙血树资源，便于推广应用，解决 血竭药用资源紧张的问题。 为实现上述目的，本发明采用的技术是先培养真菌，再将真菌接种到龙血树的树 干上。经过一段时间后，在接种孔的周围会产生与血竭化学成分相似的红色物质。本发明 采用的l株真菌经鉴定为镰孢属真菌D-22(Fusarium sp.)，保藏编号CGMCC No. 2598，该菌 株于2008年7月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位 地址北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所。菌株的保藏和存活证明见附 件。 真菌D-22的培养特性为在PDA培养基上菌落为粉色，气生菌丝丝状，菌落背面为 红褐色，分泌红褐色物质，生长1周菌落直径为5. 2cm ;小型分生孢子单胞，椭圆形，有时两 端略弯曲，3. 4-12. 1 X 1. 4-3. 4 ii m ;大型分生孢子，多胞，镰刀形，37. 6 X 4. 0 y m，少见。
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具体地说，本发明所述的技术步骤方法如下
1.真菌的培养 将由龙血树茎部分离得到的保藏编号为CGMCC No. 2598的真菌D-22自低温保藏 的斜面试管菌种活化后，转接于PDA培养基的平皿中，恒温培养15-20天；或转接于PDA液 体培养基或麦麸液体培养基中，恒温震荡培养5-15天，或转接于锯末麦麸固体培养基中， 恒温培养20-50天；培养温度均为22-28°C。 将上述培养的菌种接种到含有锯末、树叶和麦麸的锯末复合固体培养基中进行培 养，待菌丝长满培养基后直接使用。锯末复合固体培养基中锯末、树叶和麦麸的重量比为 2:1: 0.5 ;或将PDA平皿培养的菌种，在菌落边缘打孔成菌片，接入PDA液体培养基或麦 麸液体培养基中，培养5-15天后取发酵物使用。
2.真菌的接种 选取树龄5年以上的剑叶龙血树或小花龙血树的树干或离体树干，通过钻孔的方 式在树干形成直径O. 5-3cm，深2-15cm的接种孔，或通过横向切割、或纵向切割、或从上向 下斜向切割的方式，在树干形成长l-6cm，宽l-6cm，深1-6cm的接种槽。接种孔或接种槽的 间隔是纵向间隔5-15cm，横向间隔3-10cm。在接种孔中接入锯末复合固体培养基培养的菌 种或液体培养基培养的发酵物，在接种槽中接入锯末复合固体培养基培养的菌种。接种后 用聚丙烯薄膜包扎接菌孔。经过3-10个月后，接种孔周围能产生与血竭化学成分相似的红 色物质。
具体实施方式
实施例1 PDA培养基平皿中培养的真菌D-22接种在锯末复合固体培养基上生长30天，备 用。 选取树龄为10年的小花龙血树，用直径为lcm的钻头在树干上钻孔9个，孔深为 5-6cm，各个孔洞间的间隔均为10cm，其中3个孔洞中接入灭菌后的锯末复合固体培养基作 为对照，其它6个孔洞中接入上述培养30天的真菌D-22，聚丙烯薄膜包扎接菌孔。
6个月后进行观察，对照的孔洞周围均无红色物质分泌产生，接入真菌D-22的孔 洞周围均有红色物质分泌产生。收集孔洞周围呈现红色的木质部，提取后检测，证实其与血 竭的化学成分相似。观察后在原接种部位再次接入真菌D-22。
实施例2 PDA培养基平皿中培养的真菌D-22接种在PDA液体培养基中发酵培养10天，收集 发酵物，灭菌后备用。 选取树龄为8年的小花龙血树，用直径为0. 2cm的钻头在树干上钻孔9个，孔深为
7-8cm，各个孔洞间的间隔均为10cm，其中3个孔洞中接入灭菌后的PDA液体培养基作为对
照，其它6个孔洞中接入上述灭菌后的真菌D-22发酵物，聚丙烯薄膜包扎接菌孔。 6个月后进行观察对照的孔洞周围均无红色物质分泌产生，接入真菌D-22发酵
物的孔洞周围均有红色物质分泌产生。收集孔洞周围呈现红色的木质部，提取后检测，证实
其与血竭的化学成分相似。 实施例3
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麦麸液体培养基培养的真菌D-22接种在锯末复合固体培养基上生长30天，备用。
选取直径为10-25cm的剑叶龙血树木段，对木段进行灭活处理。用直径为1cm的 钻头在木段上钻孔9个，孔深为5-6cm，各个孔洞间的间隔均为10cm，其中3个孔洞中接入 灭菌后的锯末复合固体培养基作为对照，其它6个孔洞中接入上述培养30天的真菌D-22， 聚丙烯薄膜包扎接菌孔。 木段于24-26t:环境中放置6个月后进行观察，对照的孔洞周围均无红色物质分 泌产生，接入真菌D-22发酵物的孔洞周围均有红色物质分泌产生。收集孔洞周围呈现红色 的木质部，提取后检测，证实其与血竭的化学成分相似。
实施例4 PDA培养基平皿中培养的真菌D-22接种在PDA液体培养基中发酵培养10天，收集 发酵物，灭菌后备用。 选取直径为10-25cm的剑叶龙血树木段，对木段进行灭活处理。用直径为0. 2cm的 钻头在木段上钻孔9个，孔深为7-8cm，各个孔洞间的间隔均为10cm，其中3个孔洞中接入 灭菌后的PDA液体培养基作为对照，其它6个孔洞中接入上述灭菌后的真菌D-22发酵物， 聚丙烯薄膜包扎接菌孔。 木段于24-26t:环境中放置6个月后进行观察，对照的孔洞周围均无红色物质分 泌产生，接入真菌D-22发酵液的孔洞周围均有红色物质分泌产生。收集孔洞周围呈现红色 的木质部，提取后检测，证实其与血竭的化学成分相似。
实施例5 锯末麦麸固体培养基培养的真菌D-22接种在锯末复合固体培养基上生长30天， 备用。 选取树龄为8年的剑叶龙血树，在树干上采用以下4种方式形成接种孔或接菌槽 (1)钻孔，接种孔直径lcm，深6cm ; (2)横向切割，形成长5cm，宽2cm，深3cm的凹槽；(3)纵 向切割，形成长2cm，宽5cm，深3cm的凹槽；(4)从上向下斜向内切割，形成长5cm，宽0. 5cm， 深3cm的凹槽。每个接种孔或接种槽的间隔均为10cm。在方式(1)-(4)的接种孔或接种槽 中接入上述培养30天的真菌D-22，聚丙烯薄膜包扎接菌部位。以上每种方式重复3次。
6个月后进行观察接入真菌D-22的接种孔或接种槽周围均有红色物质分泌产 生。收集孔洞周围呈现红色的木质部，提取后检测，证实其与血竭的化学成分相似。
权利要求
一种应用真菌诱导龙血树产生血竭的方法，包括步骤(1)真菌的培养将由龙血树分离得到的保藏编号为CGMCC No.2598的真菌D-22自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于PDA培养基的平皿中，恒温培养15-20天；或转接于PDA液体培养基或麦麸液体培养基中，恒温震荡培养5-15天，或转接于锯末麦麸固体培养基中，恒温培养20-50天；将上述培养的菌种接种到锯末复合固体培养基中进行培养，待菌丝长满培养基后直接使用；锯末复合固体培养基含有锯末、树叶和麦麸，它们的重量比为2∶1∶0.5；或PDA平皿培养的菌种，在菌落边缘打孔成菌片，接入PDA液体培养基或麦麸液体培养基中，培养5-15天后取发酵物使用；(2)真菌的培养特性保藏编号为CGMCC No.2598的菌株D-22为镰孢属(Fusarium sp.)真菌，在PDA培养基上菌落为粉色，气生菌丝丝状，菌落背面为红褐色，分泌红褐色物质，生长1周菌落直径为5.2cm；小型分生孢子单胞，椭圆形，有时两端略弯曲，3.4-12.1×1.4-3.4μm；大型分生孢子，多胞，镰刀形，37.6×4.0μm，少见；(3)真菌的接种接种真菌的方法为选取树龄5年以上的龙血树树干，通过钻孔或挖槽的方式在树干形成直径0.5-3cm，深2-15cm的接种孔或长1-6cm，宽1-6cm，深1-6cm的接种槽；在接种孔或接种槽中接入锯末复合固体培养基培养的菌种，或接入液体培养基培养的发酵物；接种后用聚丙烯薄膜包扎接菌孔或接种槽；用上述方法在龙血树的树干上接种真菌一次，或在第一次接种真菌后，在接种孔周围形成血竭样红色物质的初期或中期，在原接种部位或在红色物质形成区域中，用上述方法重复接种真菌。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法适用的树种为百合科龙血树属小 花龙血树和剑叶龙血树。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于用于打孔或挖槽，接种真菌D-22的龙血 树树干为树龄5年以上的活体龙血树树干或树龄5年以上的离体龙血树树干。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于在树干挖接种槽的方式包括横向切割形 成凹槽，纵向切割形成凹槽，或从上向下斜向形成凹槽。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于龙血树树干上接种孔或接种槽的间隔是纵向间隔5-15cm，横向间隔3-10cm。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于接种真菌D-22后，龙血树树干上的接种 孔或接种槽周围能产生与血竭化学成分相似的红色物质。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用真菌诱导龙血树产生血竭的技术方法，所用的1株真菌为镰孢属(Fusarium sp.)真菌D-22，内容包括真菌的培养方法和真菌的接种方法。应用该项技术，可以诱导龙血树的树干分泌产生与血竭化学成分相似的红色物质。该项技术工艺简便，生产成本低，周期短，充分地利用和保护了龙血树资源，便于推广应用。
文档编号A01G7/06GK101779578SQ20091000025
公开日2010年7月21日 申请日期2009年1月15日 优先权日2009年1月15日
发明者孟志霞, 王春兰, 郭顺星, 陈晓梅, 龚利娟 申请人:中国医学科学院药用植物研究所