一种微生物近自然纯培养的微孔滤膜培养装置的制作方法

专利名称：一种微生物近自然纯培养的微孔滤膜培养装置的制作方法
技术领域：
本实用新型属于微生物培养技术领域，具体涉及一种微生物近自然纯培养的微孔滤膜培养装置。
背景技术：
自然界中微生物多样性越来越受到各国科学家的关注，科学家根据现有的科学证据推测微生物种类数目应该在105-106。但令人遗憾的是，仅有5,000种以下的原核生物被文献描述过，流行的Approved List of Bacterial Names记载了3,500种，权威的Bergey氏手册中记录了3,100种。这也就是意味着所知细菌可能仅占环境细菌多样性的1％或者更少。显然，99％未曾描述过的原核微生物肯定有着更多的遗传、代谢和功能多样性，是一种看不见的国家资源。
微生物的研究长期以来受到培养方法和培养装置的限制。德国医生罗伯特·科赫(Robert Koch，1843-1910)曾用煮沸消毒的土豆来培养细菌；1887年，Richard Petri发表了一篇短文，对Koch平板技术作了又一次的改进，设计了我们今天所使用的培养皿(Petri dish)。从那时到现在，纯培养技术(pure culture technique)就被频繁和常规地在微生物实验室里用于分离、纯化、活细胞计数和培养微生物，一直成为研究微生物的基石，以至于这一方法看起来也理所当然。在这一百多年来，微生物学取得了长足的进步，新的微生物不断地被分离出来，但这远是很少一部分自然资源。Amann RI等(1995)报道，使用标准微生物学培养技术对不同生境微生物可培养性(culturability)的测定来看，海水中微生物的可培养性约为0.001～0.1％，淡水约为0.25％，土壤约为0.3％，活性污泥为1～15％左右。有些微生物被许多实验室证实是活动的，但却不可培养，成为一种活动的但不可培养(viable but nonculturable，VBNC)状态，至少有16个属的30种细菌被报道有此现象发生。虽然自然培养、富集培养(enrichment culture)等为培养微生物提供了适宜的营养和生理组合，然而，最后的分离、纯化仍然离不开传统的纯培养技术。因此，微生物的纯培养技术的局限性，无疑已经成为了微生物学进一步研究发展的一个瓶颈，仍然需要进一步寻找新的培养手段和方法。
近年来，随着分子生物学的飞速发展，利用分子技术研究自然生境微生物的非培养法(culture-independent method)越来越多地被广泛使用，有些甚至使用一些能够在原位进行研究的技术，这些在很大程度上跨越了遏制微生物研究必须纯培养这个瓶颈，不断地揭示出自然界新的16S rRNA序列类型，使得我们能够认识越来越多的微生物。现在，约有40个细菌类群成为已知，其中1/3的类群完全由未培养(nonculturable)细菌组成，它们仅以16S rRNA序列方式被记录下来。在许多环境中，这些新细菌类群和谱系占优势地位。但是，得到的这些微生物序列，对其形态、生理代谢、遗传和生态功能等方面的知识仅仅是靠推测获得；另外，那些只有在微生物被培养出来才能够产生的化学物质，如今也不可能被研究和获得。因此，虽然非培养法已经有了长足的进步，但为了完全了解微生物在自然环境中的功能角色，现有的富集和分离策略就需要提高，仍然需要发展新的培养方法。但迄今为止，增强微生物的可培养性、把更多的未培养微生物(nonculturable microorganism)转变成为可培养仍然只是微生物学家的一个梦想。
为什么众多的微生物难以用纯培养法被培养在人工培养基上呢？这是因为纯培养法本身是指从自然界中只将特定微生物分离出来，在人工培养基上增殖，这意味着被培养微生物是处于一种同自然界其它微生物和大多数有关物质隔绝的单纯条件下。然而，自然细菌群落具有高度多样性，微生物原来生存的自然生境要复杂、丰富得多，因此很难用一套培养装置和方法让大多数细菌生长。另外，还有一系列的因素阻碍了微生物在人工培养基上的复原和培养(1)许多微生物的复原需要提供天然样本中的原始生态环境，这些小生境(niche，或称为生态位)难以在人工条件下复原，极微小的变化都有可能使其丧失生活力(viability)。
(2)纯培养中极度变化的营养水平甚至可能成为主要生长障碍，特别对贫营养水体中的微生物和那些生存策略(K-选择)适宜于低营养含量和很低生长率的种类，提供营养成分丰富的培养基反而成为阻碍微生物复原的重要因素，甚至底物加速死亡(substrate-accelerated death)。
(3)对细菌培养的潜在重要的ATP(它在海水淡水中的浓度可达1nM，很可能源自浮游植物和其它浮游生物)和其它活性物质，纯培养阶段很难被提供，而且很难以活性状态提供。
(4)微生物的自然生态环境中许多种类相互依存，同一生境的微生物之间联系千丝万缕，细胞与细胞之间有着广泛的通讯和联系，在大多数饥饿状态下微生物基因表达所涉及的cAMP、大多数革兰氏阴性菌间的N-乙酰高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactones)都有可能是细胞之间沟通的信号分子，这些正逐渐被微生物学的不断发展所揭示和证明。
(5)共代谢(cometabolism)方式是很可能是微生物在自然界中生存的重要模式之一，共栖、互生、共生便是微生物自然生态关系中共同协作生存方式的不同层次。
显然，传统的微生物纯培养方式完全隔绝了被培养微生物同外界的交流和通讯，使其难以获得特定生境和特定生物的活性物质，因此，自然界中的大部分微生物从其原生环境中被带走时就会萎缩、凋谢，难以被现有纯培养方法培养或可培养性很低(lowculturability)。
长期以来，微生物学家为了进一步加强微生物可培养性、改善微生物从环境样本中复原的状况，主要从两个不同的角度来进行研究一是试验如何尽量在自然条件下使微生物增殖，称为自然培养法；二是探索在普通的纯培养中，加入什么样的新条件便可大大地接近自然条件，既近自然培养法。土壤微生物学家维诺格拉德斯基(Winogradsky)很重视微生物的自然培养，建立Winogradsky Column用于富集硫化菌和硝化菌，并成为微生物富集培养的先锋；Rossi-Cholodny埋片法(Rossi-Cholodny buried slide technique)仍然是自然培养的最好的例子，Henrichi(1932)的报告认为，载玻片在淡水中保持一定时间后，在显微镜下可观察到多种多样的未知微生物；Aristovskaya和Parinkina(1962)等前苏联土壤微生物学者提出的毛细管测数法也是一种在自然条件下的增殖培养。对近自然纯培养的研究，则多是在增殖培养基的组成方面尽量接近在自然界活动的微生物的营养条件，如用土壤抽提液作为培养土壤微生物的基本成分，河水或海水作为必要的添加来培养各自水体中的微生物，植物汁液加入培养基用于培养植物病原菌等，但在该方面仍然没有取得革命性的进步。该思想最成功的范例应该是Kaeberlein T等(2002)在Science杂志上的报道，他们使用了微孔滤膜、中间加隔片的装置对沙滩微生物进行过培养，模拟沙滩生境，结果他们获得了成功，证明该方法能够有效地增强部分微生物的可培养性，而且已经有两个菌株被证明是以前的未培养微生物(nonculturable microorganism)，但遗憾地是他们并未形成一套完整的、可通用的微生物近自然纯培养方法和装置。
微生物学中长期以来使用微孔滤膜来过滤液体或者收集微生物，产品有各种各式的微孔滤器；滤膜培养法(filter method)中还将收集微生物后的膜直接放入培养基中培养，一些公司甚至将其进一步商品化，设计为培养基同微孔滤膜构成一体，如检验用的便携式微孔滤膜菌落计数板，还有德国赛多利斯(Sartorius)公司的实验室微孔过滤产品NPS(Nutrient Pad Set)套件(滤膜+培养基+培养皿)等，都只是微生物检测用的培养基套件；微生物学中的透析培养系统，只是为了将微生物细胞与营养物及产物分开的连续培养装置，或者将微生物进行富集培养的一种装置；中国和其它国家许多动物细胞和组织培养的专利和产品中，很多都使用微孔滤膜作为培养动物细胞和组织的支撑，如细胞化学趋化功能分析中的Boyden chamber系统，Opticell的透明细胞培养卡等；在中国专利中，申请号为87106707的“微生物培养和检测的设备和方法”叙述了选择性地培养活动细菌，适合于部分细菌的复苏；申请号为02120114.5的“微生物及细胞的液体培养方法及其培养装置”中使用了微孔薄膜作为进行气体交换的隔膜的方法和装置。所有的这些装置要么是不能使被培养微生物同外界相交流，要么不适宜微生物在其上纯培养和形成菌落，要么没有形成完整可进行微生物纯培养的通用实验装置。

发明内容
本实用新型的目的在于针对现有培养装置存在的不足，在充分研究阻碍自然界微生物复原和纯培养的不利因素基础上，提出了一种继承和发扬近自然培养法思想的、为微生物提供不割断活性物质和通讯来源的微生物纯自然培养的微孔滤膜培养装置，该装置可保证被培养的微生物能够同外界环境交流和通讯，但微生物本身不可逃逸和被污染，达到增强部分微生物的可培养性、甚至将部分未培养微生物转变为可培养(culturable)的目的。
申请人经过多年的研究实验中发现，在培养微生物时，如果在移植它们时创造一个被纯培养微生物所需要的外部环境，提供其原生环境中的化合物组成及其共同生活的微生物，让其感受到它们所有的环境和邻居没有变化或者变化足以忍受，那么这些微生物就不会知道它们被移动了，就会又有许多微生物会被培养出来。经研究总结，申请人发明了本培养装置该装置是在传统培养微生物的容器下部穿孔，让其同外界相通，这些有孔容器的内部衬有一层到数层微孔滤膜，微孔滤膜的功能是使被培养微生物与外部环境相隔开，允许被培养微生物同外界细胞进行交流、通讯，吸收外界环境中的生物活性物质，但却不允许膜内微生物逃逸和被污染；而有孔容器是为微孔滤膜提供了支撑和保护，同时可以在不改变现有微生物实验室其它条件下完成近自然培养，大大地增强部分微生物的生活力和可培养性。
微孔滤膜的孔径大小是根据不允许微生物细胞本身通过、但允许膜两边细胞通讯和交流活性物质的要求来确定，选择对微生物无毒或低毒的微孔滤膜。微孔滤膜可以松散地内衬在有孔容器内，也可以进一步工业化将二者合为一体，可以覆盖有孔容器全部内表面，也可是一个有孔容器内表面的一部分，微孔滤膜可以是开放或全闭合。
微孔滤膜内的培养基可以是固体、液体或半固体培养基。
本装置的使用方式首先将本培养装置灭菌加入无菌培养基后，先将培养装置放入被培养微生物所需的自然环境中，让培养装置中培养基同外环境中活性物质相互渗透保持一致；平衡一定时间后，在无菌条件下接种微生物，继续放回原生环境中培养直至获得所需微生物，通过培养装置既允许微生物同外界通讯和交流活性物质、但又不允许微生物细胞逃逸和通过。
使用中应该注意的是(a)在进行微生物固体培养时，培养基中固化剂成分含量应该比通常培养基制备中量稍高一些，防止由于外界环境中渗透液过度进入而破坏固体培养基形态；(b)培养前外环境液面可高于内部培养基平面，压差促进内外平衡；(c)固体培养时，外环境中的液面通常不应高于里面培养基高度，培养基表面无明显水渍形成，以有利于固体培养时菌落的形成；液体培养时则需调节内外液面和渗透压；(d)培养过程中，外环境物质不能以除透过微孔滤膜的其它方式进入；(e)其外部环境是指被培养微生物所需的任何环境，可以是自然环境，也可是人为创造的环境，包括各种水体和含液体的环境，如土壤、沙滩或沼泽，甚至可以是活体植物或动物组织和个体。
利本实用新型的装置，在不改变现有微生物实验室的其它条件的基础上，为许多微生物的复苏和生长提供所需环境，不仅可以大大增强活动细菌的可培养性，特别那些是贫营养状态下的微生物，甚至有可能将现阶段微生物学领域认为的未培养微生物中的一部分培养出来，使我们寻找更多的微生物资源成为可能。


图1A是本实用新型的一种培养装置——有孔培养皿立体图；图1B是有孔培养皿的剖视图；图2A是本实用新型的一种培养装置——有孔三角瓶立体图；图2B是有孔三角瓶的剖视图；图3A是本实用新型的一种培养装置——有孔试管立体图；图3B是有孔试管的剖视图。
具体实施方式
接下来将参照附图描述本实用新型本装置有多种形式，以下例举几种参见图1A和图1B，此为内衬有微孔滤膜的有孔培养皿。1为皿体，其底部有数个孔洞5；2为皿盖；3为微孔滤膜，覆盖于培养皿内表面；4为固体培养基。微生物培养和分离时，将1，2，3包装好灭菌，加入固体培养基4，冷凝后待用。培养前，首先该装置放入被培养微生物所需的环境中，让外环境液面高于固体培养基4的表面，压差促进内外平衡；接种微生物，继续放回原生环境中培养，此时的外环境液面应控制为不高于固体培养基4的表面，以保证固体培养基4表面无明显水渍，有利于微生物菌落形成。
参见图2A和图2B，此为内衬有微孔滤膜的有孔三角瓶。6为三角瓶，其特征为底部和瓶壁的下部有孔洞5；内衬微孔滤膜3；加上棉塞8，灭菌后加入无菌液体培养基7，可进行微生物的液体培养。培养前将该装置放入外环境中平衡，接种后继续放入外环境中培养，此时应注意调节内外液面以维持渗透压的平衡。该装置可用于微生物细胞的液体培养。
参见图3A或图3B，此为内衬有微孔滤膜的有孔试管。9为有孔试管，其特征为试管底部、下部有孔洞5；内衬有微孔滤膜3；加上棉塞8，灭菌后加入无菌固体培养基4，制作斜面，冷凝后可用于微生物菌株纯化、转接和菌株保藏等。培养前应将有孔试管放入外环境中，让外环境液面高于固体培养基4平面，压差促进内外平衡；培养时外环境的液面不高于斜面最下部，以保证固体培养基4表面无明显水渍，有利于微生物形成菌苔。
以上装置中微孔滤膜的选择要求①孔径大小应允许膜两边微生物活性物质交流和通讯，但微生物细胞不能通过，一般常用为0.2μm，0.25μm，0.45μm等，特殊时可选用更小、更大孔径滤膜；②膜对微生物无毒或低毒；③膜为亲水性，如聚碳酸酯膜、醋酸纤维膜等等；④能够承受121℃高温灭菌后仍保持其原有特性。
微孔滤膜的使用先用少量清水或无菌水将其润湿，使其更加柔软，从而能更紧密同有孔容器内表面相贴近(特别是有孔试管，管壁较深，不易熨帖)。
以上装置为实验室规模下采用。有孔容器和微孔滤膜可以被进一步合为一体，可以扩大进行工业化和批量化生产，可以有其它称谓，但方法特征不变。
使用过程微生物培养和分离时，将衬有微孔滤膜的有孔培养皿(如图1A)包装灭菌，加入无菌培养基，冷凝后待用。培养前，首先该有孔培养皿放入被培养微生物所需的环境中，让外环境液面高于培养基的表面，压差促进内外平衡，让培养皿中培养基同外环境中活性物质相互渗透、平衡，保持一致。平衡一定时间后，在无菌条件下划线或其它方式接种微生物，继续放回原生环境中培养，此时的外环境液面应控制为不高于培养基的表面，以保证培养基表面无明显水渍，有利于微生物菌落形成；但如果使用倾倒平板技术(pour plate technique)时，则在琼脂和被培养微生物倒入该装置后，等待琼脂冷凝，直接放入被培养微生物所需的环境中培养。微生物菌株保藏则使用有孔试管和微孔滤膜的装置，灭菌后加入无菌培养基，冷凝，制成斜面待用；使用时，将该装置放入外部环境中平衡，外环境液面可高于培养基内表面，但应保证接种时培养基表面无明显水渍，有利于菌苔的形成；培养时，外环境液面通常不高于斜面下端。使用该方法微生物液体培养时，采用内衬微孔滤膜的有孔三角瓶，加入液体培养基，放入微生物需要的外环境中平衡；平衡一定时间后，接种，继续放入外环境中培养；培养时，应该注意调节内外液面和渗透压的平衡。
本实用新型是在深入研究传统纯培养方法的弊端后提出和产生的，因此，在传统纯培养装置中能进行的工作，利用本装置都能进行，如有孔培养皿同样可用于微生物纯培养、菌株分离、活细胞计数等，有孔三角瓶可用于菌株液体培养、代谢产物的生产等，有孔试管可以用于纯种分离、传代培养和菌株保藏等。但是，该装置为被培养微生物提供了一个同外环境沟通的可能，只要有需要就可以将其放入原生环境中获得外界环境中的信息和产物，这是传统纯培养装置所不能提供的。在使用本装置和传统装置进行培养比较的初步测定中，对泉水、温泉水、江水、贫营养湖、富营养湖、活性污泥中的微生物可培养性进行了测定，在相同培养情况下(如培养基成分、pH值、温度)，近自然微孔滤膜培养法平皿中出现的菌落数明显比传统培养法平皿中的要多，统计表明呈显著或极显著差异。
权利要求1.一种微生物近自然纯培养的微孔滤膜培养装置，其特征在于该装置是一种下部有孔的容器结构，容器内衬有一层或者数层微孔滤膜，滤膜内加有培养基。
2.根据权利要求1所述的微孔滤膜培养装置，其特征是微孔滤膜松散地内衬有孔容器内。
3.根据权利要求1或2所述的微孔滤膜培养装置，其特征是微孔滤膜和有孔容器合为一体。
4.根据权利要求1或2所述的微孔滤膜培养装置，其特征是微孔滤膜覆盖有孔容器全部内表面或内表面的一部分。
5.根据权利要求1或2所述的微孔滤膜培养装置，其特征是微孔滤膜是开放或全闭合形式。
6.根据权利要求1或2所述的微孔滤膜培养装置，其特征是微孔滤膜内的培养基是固体、液体或半固体培养基。
专利摘要本实用新型公布一种以近自然培养法为原理的微生物近自然纯培养的微孔滤膜培养装置，装置为有孔的培养容器，容器内衬有一层至数层微孔滤膜，灭菌后加入无菌培养基可用于微生物纯培养。培养时将该有孔容器放入被培养微生物所需的环境中，使膜内微生物可同外界微生物交流和通讯、但膜内微生物又难以逃逸或被污染，从而使被培养微生物获得一种接近自然的培养条件。该培养装置可增强许多自然环境中微生物的可培养性，甚至使部分未培养微生物的分离纯化成为可能。
文档编号C12M3/00GK2737799SQ200420060079

公开日2005年11月2日 申请日期2004年6月30日 优先权日2004年6月30日
发明者叶姜瑜 申请人:重庆大学