专利名称：一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高重组蛋白表达水平的技 术方案。
背景技术：
酵母是一类单细胞的低等真核生物，兼有原核和真核细胞的特点既培养 方便，繁殖快，成本低，易于基因操作，又具有分泌途径，可对真核基因产物进 行翻译后加工修饰，得到正确折叠、有活性的蛋白质。因此酵母表达系统被誉为 最有商业价值的表达系统(F. R. Schmidt, Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry, Appl Microbiol Biotechnol ，65:363—372， 2004)。除应用广 泛的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)禾卩巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统外，还存在一类以克鲁维酵母(Kluyveromyces)为代表的非常规酵母 表达系统。
克鲁维酵母主要包括乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维 酵母(Kluyveromyces fragilis )、马禾斗斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus) 等种类，其中乳酸克鲁维酵母是一种能够以乳酸作为唯一炭源生长的酵母，具有 营养要求极其简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广(25°C-46°C)、 分泌蛋白能力强，对人类安全(GRAS， Generally Regarded as Safe)等特点，是 一种较理想的重组蛋白表达宿主细胞，迄今已建立了适于外源基因表达的较完善 的乳酸克鲁维酵母表达系统，利用该系统人们己成功表达了人血清白蛋白、a-半乳糖苷酶、牛凝乳酶等多种重组蛋白(Albert J丄van Ooyen et al， Heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis, FEMS Yeast Res 6: 381—392, 2006)。
酿酒酵母HAP1基因(ScHAPl)编码一种转录因子，调控一些细胞呼吸代谢途径必需基因的转录表达(Pfeifer， K.， Kim, K.S.， Kogan， S. and Guarente, L. 1989. Functional dissection and sequence of yeast HAPI activator. Cell. 56: 291-301)。作为ScHAPl同源基因，乳酸克鲁维酵母HAP1基因(K1HAP1)的功 能目前尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达水平的新方法。
本发明提供了一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的方法，该方法包
括如下步骤
(1) 将菊粉酶基因的启动子、a-信号肽、目的蛋白和菊粉酶基因的终止 子编码序列依次连接；(菊粉酶基因的启动子和终止子序列见GenBank登入号 AF178979; a-信号肽的GenBank登入号J01340)
(2) 将(1)得到的序列插入克鲁维酵母表达载体pUKD-S或者pUKD;
(3) 用(2)获得的重组载体转化克鲁维酵母，发酵，取发酵上清液分离即可。
本发明中，(3)中采用的克鲁维酵母可以是乳酸克鲁维酵母、鹰嘴豆克鲁 维酵母、马科斯克鲁维酵母或者脆壁克鲁维酵母。
本发明中，所用的乳酸克鲁维酵母可以是MW179-1DHAP1基因缺陷菌株。 乳酸克鲁维菌株MW179-1D信息见文献Imrichova D et al. K4W-mediated AWQ7 expression in A7^yverowycej /fl"/s, FEMS Yeast Research, 5 (4-5): 323-329， 2005。
本发明中，(1)中启动子可以是通过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179 (出处见 Zhang J et al. Cloning of the 尺cf/Z ^ Gene and Development of a Transformation System for A7t(yveromyces "'cm'spo阳s ， Appl Microbiol Biotechnol.， 62(4):387-391,. 2003.)的总DNA为模板，以PI和P2为引物，PCR 扩增获得的；PI的序列如SEQIDN0 2所示，P2的序列如SEQ ID NO 3所示。
本发明中，(1)中终止子可以是通过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179的总DNA 为模板，以P5和P6为引物，PCR扩增获得的；P5的序列如SEQIDN0 6所示，P6的序列如SEQ ID NO 7所示。
本发明中，(1)中的目的蛋白可以是酶、细胞因子、多肽、抗体或者疫苗 抗原。本发明中的重组蛋白可以是商业上有用的蛋白质，包括酶、细胞因子、多 肽、抗体、疫苗抗原，编码该蛋白质的基因可以来自微生物、植物、动物或人。
本发明的一个实施例中，(1)中的目的蛋白可以是菊粉酶。
本发明中，a-信号肽和菊粉酶编码序列通过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179的 总DNA为模板，以P3和P4为引物，PCR扩增获得的；P3的序列如SEQ ID N04 所示，P4的序列如SEQ ID NO 5所示。
菊粉酶(inulinase)是一类水解卩-2,l-D-多聚果糖果糖糖苷键的一类水解酶。 菊粉酶根据其酶切多聚果糖糖链的方式分为外切酶(EC3.2丄80)和内切酶 (EC3,2丄7)。产生菊粉酶的微生物主要为真菌。鹰嘴豆克鲁维酵母菊粉酶基因 GenBank登入号为AF178979，启动子和终止子序列包括在内。菊粉酶在以下方面 有重要的应用前景。第一是高果糖浆的制备。高果糖浆是理想的天然甜味剂，果 糖的甜度比蔗糖高出80%;能适合糖尿病人食用。同时还具有营养保健功能，能 调节肠胃、提高免疫力、排毒养颜、降解血糖和抗癌等优越的生理学活性，被称 为第三代功能食品。第二方面，是生物能源领域的应用。目前，生物乙醇的生产 主要是以玉米淀粉为原料，原料的种植面临与人用粮食争夺土地的尴尬。菊芋的 主要成分菊粉，它的生长条件粗狂，种植不占用耕地，不仅能生长盐碱地，还能 生长在沙漠地区，能防止土地沙化，以菊粉为原料生产生物乙醇可以成为目前淀 粉乙醇的补充和后备方法。菊粉在菊粉酶的作用下，水解成单糖，能直接被酵母 利用，产生乙醇。因此，制备菊粉乙醇是否可行关键是成本的高低，这其中生产 菊粉酶成本是关键中的关键。
本发明的方法具体说明如下
1.菊粉酶基因启动子、终止子控制的重组蛋白克鲁维酵母表达质粒构建。 (1)重组蛋白基因表达盒构建
以克鲁维酵母基因组DNA为模板，设计特异性引物，利用PCR技术分别扩 增外切菊粉酶基因启动子和终止子序列，再通过PCR扩增重组蛋白基因序列，将 菊粉酶基因启动子、终止子和重组蛋白基因序列分别进行限制性内切酶酶切处
理，经过DNA连接酶的连接反应，将菊粉酶基因启动子、重组蛋白基因和菊粉 酶基因终止子序列依次克隆于pBS—SK质粒上，获得由菊粉酶基因启动子、重组 蛋白基因和菊粉酶基因终止子序列三种元件构成的重组蛋白基因表达盒。采用的 PCR、酶切、连接、大肠杆菌转化等基因工程技术方法均为常规方法，参照《分 子克隆实验指南》(J.Sambrook,etal.,第二版，1996)。 (2)重组蛋白克鲁维酵母表达质粒构建
pUKD-S是在克鲁维酵母中高度稳定的载体，由克鲁维酵母质粒pKDl、鹰 嘴豆克鲁维酵母KcURA3基因和大肠杆菌pUC19序列构成。将载体pUKD-S用限 制性内切酶Sse3871切开，用Klenow酶填平粘性末端；将克隆PBS-SK质粒上的重 组蛋白表达盒用限制性内切酶切下，表达盒片段经分离后，也用Klenow酶填平 粘性末端。然后，表达盒片段和载体pUKD-S片段用DNA连接酶连接，得到菊粉 酶基因启动子和终止子控制的重组蛋白基因克鲁维酵母表达质粒。 '
2.菊粉酶基因启动子、终止子控制的重组蛋白克鲁维酵母表达质粒导入 HAP1基因缺陷型克鲁维酵母菌株，构建重组蛋白表达工程菌。
将菊粉酶基因启动子和终止子控制的重组蛋白基因克鲁维酵母表达质粒用 LiAc完整细胞转化方法导入HAPl基因缺陷的克鲁维酵母菌株(Ura3一)，筛选能 在缺少尿嘧啶的选择性培养基中生长的酵母菌，即得到重组蛋白克鲁维酵母基因 工程菌株。酵母细胞LiAc转化方法参照《酵母遗传学方法实验指南》(A. Adams, etal.,2000)。
另一方面，本发明还提供了一种用于提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量 的载体，该载体由菊粉酶基因的启动子、a-信号肽、目的蛋白、菊粉酶基因的 终止子编码序列和载体序列组成；其中菊粉酶基因的启动子、a-信号肽、目的 蛋白、菊粉酶基因的终止子编码序列依次连接，载体是pBS一SK、 pUKD-S或者 pUKD，菊粉酶基因的启动子、a-信号肽、目的蛋白、菊粉酶基因的终止子编码 序列组成的DNA片段插入载体的多克隆位点。
本发明构建了含有菊粉酶基因启动子、终止子元件和重组蛋白基因序列的 克鲁维酵母表达质粒，并将该质粒导入克鲁维酵母菌株中，建成克鲁维酵母基因
工程菌生产重组蛋白，明显促进克鲁维酵母表达重组蛋白。本发明可用于提高多 种蛋白的表达量，为降低生产成本、扩大生产规模提供了新的方法。
图1:菊粉酶基因表达质粒pUKD-S-aF-PinuT结构示意图。
图2:乳酸克鲁维酵母工程菌Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT发酵分泌表达菊粉 酶聚丙烯酰氨凝胶电泳图。
图3:乳酸克鲁维酵母工程菌klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT发酵分泌表达菊粉 酶聚丙烯酰氨凝胶电泳图。与图2相比，菊粉酶蛋白条带的浓度大大加深，说 明其表达产量大大增加。
图4 : 乳酸克鲁维酵母工程菌Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT和 klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT发酵样品单位体积菊粉酶活性分析。其中，用黑色三 角表示的是乳酸克鲁维酵母工程菌Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT发酵样品，用黑色 方块表示的是klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT发酵样品。
图5:乳酸克鲁维酵母工程菌Kl-WT/pUKD-S-ccF-PinuT和 klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT发酵样品单位菌体生产菊粉酶活性分析。
具体实施例方式
实施例1鹰嘴豆克鲁维酵母菊粉酶基因表达质粒pUKD-S-aF-PinuT构建 ①.鹰嘴豆克鲁维酵母菊粉酶基因表达盒构建
首先，以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179的总DNA为模板，分别以P1和P2、 P5 和P6为引物，通过PCR技术扩增出鹰嘴豆克鲁维酵母外切菊粉酶基因的启动子 区DNA片段、菊粉酶基因编码区与终止子区DNA片段，再以pPIC9K质粒为 模板，以P3和P4为引物，通过PCR技术扩增出a -Factor信号肽DNA片段。 按照各个片段设计的酶切位点进行相应的限制性内切酶处理，所得3个酶切片段 与经过限制性内切酶EcoRl、 HindIII双酶切处理的质粒pBS—SK连接，获得质 粒pBS—SK-aF-PinuT，即由菊粉酶基因启动子、a-Factor信号肽、菊粉酶基因 编码区和终止子构成的菊粉酶基因表达盒克隆在质粒pBS_SK上。
所用的6条引物的核苷酸序列如下
克隆菊粉酶基因启动子片段两条引物序列是
PI: 5，AG GAATTC AAAACGACAAGAGAAGCAAACACA3，(见SEQ ID NO 2，下划线部分为BamHl酶切位点)
P2: 5， ACACTAGT ATCTAACAAAAAAAAAATTAAATGTGT3，(见SEQ ID NO 3，下划线部分为Spel 1酶切位点)
克隆a -Factor片段两条引物序列是
P3: 5" ACACTAGT TGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCA3，(见SEQ ID N04，下划线部分为Spell酶切位点)
P4: 5' ACAGATCT TCTTTTATCCAAAGATACCCCTTCTTC 3，(见SEQ IDN05，下划线部分为BglII酶切位点)
克隆菊粉酶基因编码区与终止子区片段两条引物序列是
P5: 5， ACAGATC GATGGTGACAGCAAGGCCATCAC3，(见SEQ ID NO 6，下划线部分为BglII酶切位点)
P6: 5， ATAAGCTT TAGGCAGGGCTGTGATACACCTGT3'(见SEQ ID NO 7，下划线部分为HindIII酶切位点)
②鹰嘴豆克鲁维酵母菊粉酶基因表达质粒pUKD-S-aF-PinuT构建
将①中质粒pBS—SK-aF-PinuT用限制性内切酶BamHl 、 HindIII切出菊粉 酶基因表达盒DNA片段，片段分离后用Klenow酶填平粘性末端；将酵母载体 pUKD-S用限制性内切酶Sse3871切开，也用Klenow酶填平粘性末端。然后两 者用DNA连接酶连接，得到鹰嘴豆克鲁维酵母菊粉酶基因表达质粒 pUKD-S-aF-PinuT，图谱见图1。
实施例2表达菊粉酶基因的乳酸克鲁维酵母工程菌 Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT和工程菌klhaplA/pUKD-S-ccF國PinuT构建。
质粒pUKD-S-aF-PinuT分别转化乳酸克鲁维酵母MW179-1D菌株和HAPl 基因缺陷菌株MW179-1D h叩lA,采用LiAc转化法。乳酸克鲁维酵母HAPl基 因序列为SEQ1.ID.NO 1。
① 接种单菌落到3 ml液体YEPD培养基中3(TC振荡培养16-18小时。
② 将培养物稀释到50ml液体YEPD中，使起始OD6QQ=0.2,置30。C振荡
培养3-5小时，OD600=0.4-0.6。
③ 5K， 5分钟离心收集细胞。
④ 弃培养液，用25ml无菌水悬浮细胞，再同上离心。
⑤ 弃水，用1 ml 0.1 mol/L LiAc悬浮细胞，转移到一个无菌1.5 ml离心管中。
⑥ 高速离心5秒钟沉淀细胞，去除上清，然后加入500 nl 0.1 mol/L LiAc 充分悬浮细胞。
⑦ 取50 ^细胞加到标记的离心管中，高速离心5秒钟沉淀细胞，去除上清， 然后依次
加入240 pi PEG (50%w/v) ， 36 1.0 mol/L LiAc, 10 |il ssDNA (5 mg/ml), 50 pi水和质粒DNA (0.1-1吗)。
⑧ 充分混匀细胞，置3(TC保温30分钟，然后置42℃水浴热激20分钟。
⑨ 高速离心15秒，去除上清，加入150pl无菌水悬浮细胞，然后涂布选择 性SD培养基平板，置3(TC培养。选择性SD培养基成分为0.67% YNB， 2% 葡萄糖，0.002%尿嘧啶，0.002%甲硫氨酸和2%琼脂。
实施例3乳酸克鲁维酵母工程菌Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT和 klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT发酵培养及菊粉酶表达分析
① 将乳酸克鲁维酵母工程菌Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT和 klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT分别接入3 ml选择性SD液体培养基中，在30℃ ， 250 rpm转速摇床中培养过夜后作为种子液。选择性SD液体培养基成分为0.67% YNB， 2%葡萄糖，0.002%尿嘧啶和0.002%甲硫氨酸。 ，
② 将种子液以1: 25的比例接入装有25 ml液体YEPD培养基的150 ml 三角瓶中，在30℃， 250rpm转速摇床中培养120小时。液体YEPD培养基成分 为1%酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖。
③ 每隔24小时吸取发酵液样品，5000rpm离心5min沉淀菌体，取上清液 进行表达产物菊粉酶聚丙烯酰胺凝胶电泳分析及菊粉酶活性分析。
图2和图3为120小时发酵周期中，不同时间点发酵样品聚丙烯酰胺凝 胶电泳结果，与乳酸克鲁维酵母工程菌Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT相比，
klhapl A/pUKD-S-aF-PinuT菌株产酶量明显提高。
⑤发酵液菊粉酶活性测定结果表明(图4、图5):无论单位体积酶活，还 是单位菌体酶活，HAP1基因缺陷株klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT均明显高于非缺 陷株Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT ，发酵120小时时，HAP1基因缺陷株 klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT产酶量达到391.2单位/毫升，而非缺陷株 Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT产酶量只有178.2单位/毫升，HAPl基因缺陷株产菊粉 酶量是非缺陷株的2.2倍。
序 列 表
<110〉复旦大学
<120〉 一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的方法
<130> 52
<160> 7
<170> Patentln version 3. 1
<210> 1
<211> 5079
〈212〉 廳
<213> 酵母
<400〉 1
cgagagaatatcgctaatgcccctcgatgttgtagcttatgttatggcttctaaaaactg60
tcatctgccattgcatactctttcctttttcttgcgggcttcccaccttctatactgtcc120
aacatcgaaagagagaeicctttaaaataaat3cga肌g3g3cggactgsg180
atg肌tcaggtgttgttattgtacagctcaacagaaagcc240
gt肌ttctggaataatttacctggaagt3catatatttaccg犯tttaac300
tttctttctttcatggttgttg卿g卿ctgtttaagtgattagttttcaatctattcc360
ttaacattcattcttgatagcgaaagggc￡iataggaaa肌柳gstcgggiccttgagttt420
gagataccaeigtgscgcgttgaagttcacgtatatttcgtcaattttttt480
犯ctagtttattatcacacacacagtgatagatatacaaaggtt卿ggtggatattttt540
tgaactatgagctctattacctcacctggaacaggcaccccgcagcagaagcgga卿ga600
aacagagtacccctgagctgtacaatatgtcgaa卿gga犯gttaagtgtgeic犯agga660
cggcctcagtgccagcaatgtgtcaagactggtgttggtcatctatgccattat8tgg朋720
c卿cgtgggctgaagaagccgaga卿agctgtcg犯gg3ttCggElgttgaeigcagctt780
卿g咖gtgtg犯gtctttggaaga犯ctttcatgccactacgacgaat840
cctatgaccagtgCt犯CC3gagtccgLgcgtcagatggtttgaatgtcggttgtcctcat900
gc鄉tggcagtactc肌cggctgttatccggatcc肌tggaaattcacctattctaagt960
acggaaca犯cgccatcc肌tgagaataagt3tg3t肌Cg8tg3gttgg8tttg3caaga1020
C3gttCg3t3tgttacatttggtactgtgcatcttggagctacccattgg1080
ttggcaataatgaaaggtgatccttacttaaaatttctctggggtcatatcttcacatta1140
ag卿g卿ctcacgg肌tggtattctcagaaacgga犯tatagtaccgtctccgctggt1200
gcaggtacatgtcccgtcattcatggctcacc肌atgtccagttgcac8t1260
gc犯ctaggaacgttgcagag卿ccg卿agctctg兆tcacgttgccctgtagcacat1320
gctcctaggcCtCC3C3C肌3犯tgCCCtgttgaccatagtgctttcatc1380
ggttctgctagctcgggtcaatgccccgtggcacat3ccgttgtC幼gg8卿agttgsc1440
gcaactacttctggatgtccaatagaccacac肌agttttcctttatggaaggttctcct1500
gatcctgcagct幼ggg肌agcttccggctttgccgtctttcca犯atttgscagcgaaa1560
tgtccaatgcttcgcg鄉g幼ctccaaiccccaacgttgaacagccaggaatctgggcat1620
aattcg犯acgcactagtgt3gtgCCgg3g 8tgtC3tC8gagcaggccactg8tgccata1680
agcaaggccttgccaccaaaaaaaatcgta ttccttttcatggat肌ftttctttaatcac1740
atttacccaatcgtacctatacttgatgag cagaccttcaaactacaggtaaatc犯att1800
ttgcaaacaaataataacca幼caactgtcaaeittgacgaagccgttagatgcttgtgtt1860
ttggggatsttattgattattttgag犯ta acatggctttccttgactccc幼cgcatgc1920
aatatcaagttaggaccagagtgcgaatcg ttaaaattagaacctaca/tactccgctact1980
atcacacaggctaaagaggaagccatgcta ttaaaatacgaaacacctat2040
gsg3ttgta^ggaaatttttgatc犯gtttgatgaaatcagtagtttcgc犯actccaat2100
gttaacatcaccacagttcaatttgccattttctac犯3ttgtatctcatgtcctctccg2160
gata卿cggattatacacatttacctcaaCgggtC3卿taatgagacc2220
caccaagttcttatgtccagtattgtgcaa3tggCtttC3gctgtggsttgcaccgtgat2280
cctgataatttccctcaactgtcaatggttccaagttgacga犯gaagct2340
ttgtcg犯taCCg3g3g3ttg犯acatacacctggttctttattgtctca2400
cttgatgttcaacagtctctatcactaggtacacccagattattacgtaa2460
ttcagtgacactaaacttccctgtgcatcgaagatcgattatgtgaacaat3"tcaaggaa2520
ctcatcctggtcaagaatttcacattgttcttcceifiattgacttatgtatcatctctgtt2580
ttgaatcatattttgaatgtttctcttgcaagg8C3gtteigaa犯tttgagcttgacc幼2640
c taatacaaagcttaggtaaEictacgtgatggtgttactccgacg犯tgatgttgtcaat2700
g3tCttgtt3ata肌ggcctattatttacc3cag肌ggaactgtgcttttggacca犯ac2760
CC3g3gC3ttcctattcgttaccatccttaacatccgttctttc幼cagtagata肌agc2820
tCttC2Lg33gaa犯ggaa肌gaaactcagtctcgcccacgaagagctttg2880
tttttctcaaaac3tgtc3caatt3gcatgctacaatatttgtt犯actacatcttattc2940
3CgC3tt3Cgaaccgttsggt犯cgaagaccccggcac犯g幼ttttagctaaagattat3000
gCELCELgLgaELgccctcaactatgcagtgg幼ggcttc犯aaactgcatactcttctataac3060
agcaccggt3tgaacaacatgttcagttatatggatgtgcttttgtcgcccacctgcttg3120
gacgtcggacatcgtgctttacagtttatcgtttgcct肌ttttgcgggctaaatgtggc3180
cctttaacaggtatgggtg3atccccagctaaaataacactgtt8Ct3gC3240
atgaaacagaccaaatgaagag€Lg￡LttC￡ltccccatctccagg肌acgtc3300
cttacagatgtC3gtCtgg3tgcaggtgaa肌cttagccgaagttctcctcgcaag幼tg3360
atcttatttcaaaac aaa t ctctgccaaat6Ltaactatgccgtaagaatg3420
caggtttctttatcactttacttaagaaaccttcctcgaaatccaaaact3480
aactctaaaaacaaaaacctaccacgtttgcatcaacatccaaatattgcaaatatgscg3540
agtttcttcaaaaacgttccatcattggtactttcagcagg鄉ggatca肌ttagacgt3600
tgcccggtttatcaggacgcagttgggtttttgccttcgaaagt犯caagcggaaccttc3660
aactcgatttttcactccactgctcctccttctttcaactctgccgttacac犯caattg3720
cccccactgatcaaccaatc3Ctttt3gggacactttaagacgcacatca3780
gatgtg卿ggtactcctga幼ctgcg犯atagacaccac3840
ttctctgagcaaaaagttga3gt幼3ggtggaa犯tcctcaaatatctttaccaccttct3900
CC3gCgC8g3tttctgcggtaactccctttgagcctttgcttccaactttggaca卿tg3960
cctgcagttccac肌ggaaaggttccatatcaagtttgtctgg犯cacsg4020
cctcctattgttgcaccttct犯cttacagcaattaaatttcaactctccagtacccccEi4080
tcagatttatctaacatcactgattcccctgactttgaggacttcctatccg犯cacaca4140
tcacttaatggattaatgata犯cccgtcatccatagtggaagctgttggatttgatggt4200
tattctggga ggcttg肌cg ttagatcgtt catcacttct
gg￡Lt￡Lg3Cgt
catattaata ctgcatagcfi ctg3tt犯eig atattacctc gagaccgaca aggaagtt犯 c犯gagatga cag肌tgttc a幼tgtC3tt caac3csgcc
atggtgggct aaatggcacc ttatttcaaa ttctaattgt caaattcttt tcgactgtaa eittca^gagca aaagcctgct cgctttcact actattatca gaacgtcaga ctatatataa gtgtttgtgc caacgccagt cttagcaagt
tcgcttacaa catcacagaa ca犯tca犯g ggtagttacg ttttctgttc ataccttaat tcagtatagc tcttttctat tacacatcat
3Cggg3tgCg
aatgcagcca ggttatctgt aaattgtttg agaagatccg gcagccggaa
gccgatttct ttttcgatgt ggcgtattac tgccacttat tgcttttcag taaatcatga atcgttagaa acgtatatat tttcatgcat
cttaacctta atcgaagcca catgaaccac tcgtatactc taag犯ttc
taccgataga gggaatgagt aaaagcattt agtttgcctt agttcattaa taaattgtta atcttccact taccttatat gctaatattt
aatagagaaa gaagggttca cagcgacttc tacccaaggt
taataatgat tcattgttac tcaaaattaa gtcactatcc ttaatggeict ataactgcaa ttcatgaact attaccttat 犯gtt犯tct
tcggatattt tcagtccttc tgtcgaatat gttgttgcgt
4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5079
〈210〉 2
〈211〉 32
〈212〉 DNA 〈213〉人工合成
〈400〉 2
aggaattcaa aacgac冊ga gaagc幼aca ca
32
<210> 3
〈211〉 35
〈212〉 隱 〈213〉人工合成
<400〉 3
acactagtat ct犯ca^aa aaa犯ttaaa tgtgt
35
〈210〉 4
〈211〉 34
<212〉 DNA 〈213〉人工合成
〈400〉 4
acactagttg agatttcctt caatttttac tgca
34
〈210〉 5
<211〉 35
〈212〉 DNA 〈213>人工合成
<400> 5
acagatcttc ttttatccaa agatacccct tcttc 35
<210> 6
<211> 30
<212〉 腿 <213>人工合成
〈400〉 6
acagatcgat ggtgacagca aggccatcac 30
<210> 7
〈211> 32
<212> DNA <213>人工合成
<400> 7
ataagcttta ggcagggctg tgatacacct gt 3权利要求
1. 一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)将菊粉酶基因的启动子、α-信号肽、目的蛋白和菊粉酶基因的终止子编码序列依次连接；(2)将(1)得到的序列插入克鲁维酵母表达载体pUKD-S或者pUKD；(3)用(2)获得的重组载体转化克鲁维酵母，发酵，取发酵上清液分离即可。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中采用的克鲁维酵母是乳 酸克鲁维酵母、鹰嘴豆克鲁维酵母、马科斯克鲁维酵母或者脆壁克鲁维酵母。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所用的乳酸克鲁维酵母是 MW179-1D HAP1基因缺陷菌株。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中启动子是通过以鹰嘴豆 克鲁维酵母Y179的总DNA为模板，以P1和P2为引物，PCR扩增获得的；Pl 的序列如SEQ ID NO 2所示，P2的序列如SEQ ID NO 3所示。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中终止子是通过以鹰嘴豆 克鲁维酵母Y179的总DNA为模板，以P5和P6为引物，PCR扩增获得的；P5 的序列如SEQ ID NO 6所示，P6的序列如SEQ ID NO 7所示。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中的目的蛋白是酶、细胞 因子、多肽、抗体或者疫苗抗原。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中的目的蛋白是菊粉酶。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，a-信号肽和菊粉酶编码序列通 过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179的总DNA为模板，以P3和P4为引物，PCR扩增 获得的；P3的序列如SEQ ID N04所示，P4的序列如SEQ ID NO 5所示。
9. 一种用于提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的载体，其特征在于，该 载体由菊粉酶基因的启动子、a-信号肽、目的蛋白、菊粉酶基因的终止子编码 序列和载体序列组成；其中，菊粉酶基因的启动子、a-信号肽、目的蛋白、菊 粉酶基因的终止子编码序列依次连接；载体是pBS—SK、 pUKD-S或者pUKD; 菊粉酶基因的启动子、a-信号肽、目的蛋白、菊粉酶基因的终止子编码序列组 成的DNA片段插入载体的多克隆位点。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高重组蛋白表达水平的技术方案。该方法中，首先将菊粉酶基因的启动子、α-信号肽、目的蛋白和菊粉酶基因的终止子编码序列依次连接；然后将上述序列插入克鲁维酵母表达载体；最后转化克鲁维酵母，发酵，取发酵上清液分离即得。本发明的方法可以促进克鲁维酵母表达重组蛋白的产量显著增长。本发明可用于提高多种蛋白的表达量，为降低生产成本、扩大生产规模提供了新的方法。
文档编号C12N9/24GK101386868SQ20081020034
公开日2009年3月18日 申请日期2008年9月23日 优先权日2008年9月23日
发明者静 俞, 刘建平, 李育阳, 蔡显鹏, 袁汉英 申请人:复旦大学