一种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况和范围的方法
【专利摘要】本发明属于分子标记【技术领域】，具体公开了一种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况和范围的方法。本发明将标记基因HSV-1TK整合到溶瘤性腺病毒的基因组内，得到携带HSV-1TK基因的溶瘤性腺病毒，将病毒感染治疗受体，可以利用对HSV-1TK成像的方法来间接反映溶瘤性腺病毒的表达情况和体内分布情况，从而实现非侵入和实时的监测溶瘤性腺病毒在体内复制和分布范围。另外，标记基因HSV-1TK本身也是治疗基因，与溶瘤性腺病毒在肿瘤基因治疗中能起到协同杀伤肿瘤作用。
【专利说明】一种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况和范围的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子标记【技术领域】，更具体地，涉及一种监测溶瘤性腺病毒体内复制 情况和范围的方法。
【背景技术】
[0002] 腺病毒因具有感染效率高、宿主范围广、容纳量大、非整合性等特点而成为基因转 移中最具前景的基因载体之一，并且被广泛地改造成各种类型的溶瘤性腺病毒，应用于肿 瘤基因治疗的研究之中。溶瘤性腺病毒是能特异性感染肿瘤细胞并在肿瘤细胞中大量复制 最终裂解肿瘤细胞，释放出来以感染更多肿瘤细胞的一类病毒，同时这些病毒因无法在正 常细胞内复制而对正常细胞副作用小。溶瘤性腺病毒所携带的治疗基因，在病毒复制的同 时，治疗基因拷贝数也相应增加，这样就使病毒溶瘤效应和基因治疗作用结合起来，即"病 毒-基因治疗"，起到治疗的协同效应。"病毒-基因治疗"要想成熟的运用于临床，还要考 虑病毒使用的安全性和评价治疗的有效性，即如何监测溶瘤性腺病毒在体内复制和播散情 况。
[0003] 目前常规是通过取活检用免疫组化方法来检测溶瘤性腺病毒在体内复制情况和 复制范围，但这种方法存在着明显的缺点：（1)对机体造成损伤，也不能进行重复连续观 察。（2)不能方便实时获得病毒在体内的分布和复制的信息。
[0004] HSV-1TK是一个被广泛研究的基因。不仅可用来对多种肿瘤的基因治疗。同时 HSV-1TK也是应用于分子成像较为成熟的"标记基因"。HSV-1TK酶的三个常用"标记底物" 是IUdR、GCV和FIAU，放射性标记底物可用于非侵入的分子成像。FIAU做为一个潜在的"标 记底物"，是因为它是典型的2' -氟代核苷类似物，放射性标记的碘（I)或碳（C)能掺入分子 中，可用gamma相机和SPECT成像。已有的研究表明，FIAU经放射性标记后，分子成像的稳 定性优于IUdR或GCV。基于此，以HSV-1TK基因做为"标记基因"，FIAU做为"标记底物"来 进行体内分子成像。
【发明内容】
[0005] 本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况 和范围的方法。所述方法能够实现非侵入和实时监测溶瘤性腺病毒复制、播散、分布情况。
[0006] 为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的。
[0007] -种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况和范围的方法，包括如下步骤：将标记基因 HSV-1TK整合到溶瘤性腺病毒的基因组内，得到携带HSV-1TK基因的溶瘤性腺病毒，病毒感 染治疗受体，利用对HSV-1TK体内分子成像的方法来间接反映溶瘤性腺病毒在治疗受体内 的复制情况和体内分布情况。
[0008] 优选地，所述体内分子成像的方法为gamma相机成像或SPECT成像。
[0009] 优选地，所述标记基因 HSV-1TK以FIAU为标记底物，且FIAU的集聚水平与 HSV-1TK基因表达水平成正比。
[0010] 用溶瘤性腺病毒携带标记基因 HSV-1TK，当溶瘤性腺病毒在体内复制的时候，所携 带标记基因拷贝数也相应增加。由于基因拷贝数的增加和病毒的复制情况是成正比的，通 过对目的基因分子成像，就能间接监测病毒在活体器官或组织中的位置和剂量，来反映病 毒复制和体内播散情况。
[0011] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明将标记基因 HSV-1TK整合到溶瘤性腺病毒的基因组内，得到携带HSV-1TK基因 的溶瘤性腺病毒，病毒感染治疗受体，可以利用对HSV-1TK成像的方法来间接反映溶瘤性 腺病毒的复制情况和体内分布情况，从而实现非侵入和实时的监测溶瘤性腺病毒在体内复 制和分布范围。另外，标记基因 HSV-1TK本身也是治疗基因，与溶瘤性腺病毒在肿瘤基因治 疗中能起到协同杀伤肿瘤作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1.在NCIH460TK+细胞株中，检测HSV-1TK mRNA表达、前药GCV敏感性和FIAU 集聚水平三者间的关系；（A)HSV-ITK mRNA表达与前药GCV敏感性关系；（B)HSV-ITK mRNA 表达与FIAU集聚水平的关系；（C) FIAU集聚水平与前药GCV的关系。
[0013] 图2. Gamma相机体内成像方法监测HSV-1TK基因的表达，其中，图A中箭头所示为 NCIH460TK+所成肿瘤，对侧为野生型NCIH460所成肿瘤；图B为静脉注射2-[14C]FIAU 24小 时后gamma相机成像；图C为静脉注射2-[14C]FIAU 36小时后gamma相机成像。
[0014] 图3.标记基因 HSV-1TK表达情况和溶瘤性腺病毒复制情况成线性关系。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合说明书附图和具体实施例来详细解释本发明，下列实施例并不能用于限 定本发明所保护的范围。其中关于重组载体的构建、病毒感染细胞或动物的方法均为本领 域常规的方法，另外实施例中没有详细描述的分子生物学方法都参考本领域分子生物学的 常规操作来执行。
[0016] 实施例1本发明监测方法建立的依据 一、细胞水平研究FIAU的集聚水平与HSV-1TK基因表达水平成正比。
[0017] 1、制备稳定转染HSV-1TK基因的NCIH460细胞株：转染前24h接种NCIH460细胞 到6孔板中，转染当天当细胞密度达到6(Γ80%时，用pcDNA3. 1-TK (携带HSV-1TK基因的 真核表达载体）转染NCIH460,转染方法按照转染试剂Lipofectamine2000操作方法进行。 转染48h后用G418抗生素进行筛选，以1(Γ14天细胞全部死亡的G418浓度为最佳筛选浓 度。用含维持浓度G418培养基维持细胞生长，直至筛选克隆可见为止。分离克隆放大培养 并获得一定细胞数量后，用RT-PCR和Western方法鉴定，鉴定成功的细胞即是稳定转染了 HSV-TK基因的NCIH460细胞系。
[0018] 2、筛选出稳定转染HSV-1TK基因的NCIH460细胞株，命名为NCIH460TK+。然后，评 价在NCIH460TK+中是否FIAU集聚水平与HSV-1TK基因表达水平成正比，评价过程：为了评 价在NCIH460TK+中是否FIAU集聚水平与HSV-1TK基因表达水平成正比，从两方面做了检 测：（1) NCIH460TK+ 对前药 GCV 的敏感性；（2) NCIH460TK+ 中 HSV-1TK 的 mRNA 表达水平。 结果如图1所示，FIAU的集聚水平与HSV-1TK基因表达水平以及对前药GCV的敏感性具有 高度的一致性。说明在体外实验中，用HSV-1TK做为"标记基因"，放射性标记的FIAU做为 "标记底物"，能成功的反映出细胞中所转染的HSV-1TK基因表达水平。体外实验为HSV-1TK 做为"标记基因"和FIAU做为"标记底物"的体内分子成像可行性奠定了良好的基础。
[0019] _、小鼠动物体内研究标记基因的体内表达情况。
[0020] 用Gamma相机方法体内成像检测HSV-1TK基因的表达：将步骤一的NCIH460TK+细 胞株接种裸鼠一侧皮下成瘤，对侧用野生型NCIH460成瘤做为对照。待肿瘤生长到直径为 3. 2±0. 6cm时，静脉注射50 MCi 2-[14C]FIAU，用gamma相机分别于24、36小时后进行成 像，显示出裸鼠体内分布和代谢示踪剂(如图2)。结果表明，在静脉注射2-[ 14C]FIAU 24小 时和36小时后，用NCIH460TK+所成肿瘤区域有高水平的2-[14C]FIAU来源的放射活性。而 野生型NCIH460所成肿瘤和鼠的其它器官没有显示大量放射活性。
[0021] 实施例2 一种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况和范围的方法，具体包括如下步骤： 1、将标记基因 HSV-1TK整合到溶瘤性腺病毒基因组内，得到携带HSV-1TK基因的重组 溶瘤性腺病毒，具体方法如下： (1)穿梭质粒PDC311- (hTERT-ElA)- (CMV-TK)载体构建：构建携带端粒酶启动子 (hTERT)调控E1A基因表达框和CMV启动子调控HSV-1TK基因表达框的腺病毒穿梭质粒 pDC311- (hTERT-ElA)- (CMV- TK)。
[0022] (2) Ad- (hTERT-ElA) - (CMV- TK)病毒的包装和鉴定：采用AdMax?腺病毒 系统包装腺病毒，重组穿梭质粒PDC311- (hTERT-ElA) - (CMV -TK)和腺病毒骨架质粒 pBHGlox Δ E13cre用脂质体lipofectamine 2000共转染包装细胞293,于转染后第5天经 胰酶消化，接种到l〇cm培养盘中，继续培养一周，即可观察到局部细胞形态出现变圆漂起， 随之形成典型的彗星状病变。待病变进一步扩大，大部分细胞变圆漂起时，收集细胞及其培 养液，反复冻融三次后，作为原始病毒保存于_80°C。从中取出少量用病毒空斑法筛选三轮， 获得预定的毒株，命名为Ad- (hTERT-ElA)- (CMV-TK)。采用Western blot方法检测重组 腺病毒所携带的外源基因 E1A和HSV-1TK蛋白表达情况。鉴定正确的病毒就是携带hTERT 调控的E1A表达框和CMV启动子调控TK基因表达框的重组溶瘤性腺病毒。病毒的复制特 性由hTERT所调控，可以选择性的在hTERT活性高的肿瘤细胞中进行复制，而在hTERT活性 低的正常细胞中不复制。病毒所携带的HSV-TK，在病毒复制的同时，HSV-1TK基因的拷贝数 也相应的增加。
[0023] 2.研究溶瘤性腺病毒体内分布和表达情况：在裸鼠两前上肢和一侧后下肢接种 野生型肿瘤细胞，另一侧后下肢接种携带标记基因 HSV-1TK的溶瘤性腺病毒作为阳性对 照。待肿瘤生长直径达到3±0.6cm时。从静脉给予2-[14C]FIAU。并于给予2-[ 14C]FIAU 后的4、24、36和48小时用gamma相机或SPECT成像，优化成像时间。在上述时间点体内 成像后杀死裸鼠，并迅速剥取肿瘤，用滴度测定方法检测溶瘤性腺病毒的表达量和范围，和 gamma相机和SPECT成像进行比较。
[0024] 检测结果：4、24、36和48小时用gamma相机或SPECT成像结果显示NCIH460TK+ 所成肿瘤区域有高水平的2-[ 14C]FIAU来源的放射活性，随着时间点的延长，放射活性也增 强。用滴度测定和免疫组化的方法反映体内腺病毒复制情况和范围，显示随着时间点的增 力口，病毒复制也增加，与2-[ 14C]FIAU来源的放射活性增加成正比。病毒分布的范围都可以 检测到2-[14C]FIAU来源的放射活性，结果见图3。从图3结果可知，标记基因"HSV-1TK表 达情况和溶瘤性腺病毒复制情况成线性关系。
【权利要求】
1. 一种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况和范围的方法，其特征在于，将标记基因 HSV-1TK整合到溶瘤性腺病毒的基因组内，得到携带HSV-1TK基因的溶瘤性腺病毒；病毒感 染治疗受体，利用对HSV-1TK体内分子成像的方法来间接反映溶瘤性腺病毒在治疗受体内 的复制情况和体内分布情况。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体内分子成像的方法为gamma相机成 像或SPECT成像。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记基因 HSV-1TK以FIAU为标记底 物，且FIAU的集聚水平与HSV-1TK基因表达水平成正比。
【文档编号】C12Q1/70GK104195174SQ201410375784
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月1日 优先权日:2014年8月1日
【发明者】张巨峰, 罗霞 申请人:广东药学院