利用血清miRNA量的变化比诊断肝癌的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及免疫学和分子生物学【技术领域】，尤其是一种利用血清miRNA量的变化比诊断肝癌的方法，其方法如下：收集血液样本，分离Mir-RNA，对血液中两个或两个以上Mir-RNA进行定量测定，通过测定结果计算两个或两个以上Mir-RNA的比例，通过测量多组Mir-RNA的比例范围来确定Mir-RNA变化的指标，作为诊断的依据。本发明通过测量两个或两个以上的Mir-RNA以及它们的比值来诊断肝癌，可有效提高诊断肝癌的准确率。
【专利说明】利用血清miRNA量的变化比诊断肝癌的方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学和分子生物学【技术领域】，尤其是一种利用血清miRNA量的变化 比诊断肝癌的方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 在肝细胞癌（HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，肝癌存活率非常低。在中国及1亚 洲国家，大部分的肝癌来自于乙型病毒肝炎。癌症生物学的进一步了解和技术进步已经能 够签别多种肝癌潜在的生物标志学。肝癌的早期诊断是目前治疗和延长存活率的关键。生 物标志学的检测不仅有助于预后的或复发预测，还可协助在决定治疗方法或干预措施。目 前，肝癌的诊断主要靠血清的AFP的量来判定，但其阳性诊断率非常低，且特异性也具有一 定的局限性。
[0003] 在文本中目前最常用的生物标志是甲胎蛋白（AFP)，即时每6至12个月和超声技 术的应用一起定期体检，也远远达不到我们的期望。超过400毫微克/毫升的血清AFP水 平被认为是诊断肝癌等等依据，但是，这样高的数值是在一小部分病人身上显现出来。随着 认识肿瘤生物学研究的深入和细胞和分子生物学技术的发展，早期发现及肿瘤转移生物标 记物取得了显著的进步。
[0004] 微RNA (MicroRNA，miRNA)是一个保守的家族的基因，具有重要的生物学作用，如 细胞的发育，分化，增殖，细胞凋亡和代谢。miRNA在肝脏的组织异常表达已经被证明与肝纤 维化，肝癌和肝炎有关。最近，两个独立研究小组发现miR-122对肝功能及抗肝肿瘤的生长 有做至关重要的作用（Tsai W et al JCI 122:2884-2897,2012)。miRNA在几种癌症中的 表达降低的发现，推动miRNA在癌症中作用的研究。miRNA在调节肿瘤发生的举足轻重的潜 在作用已经确定。特异性miRNA作为关键致癌基因和肿瘤抑制基因和带来了关键的问题 ： "怎么利用miRNA的表达的变化来协助肝癌的诊断及治疗的预后影响。最新研究结果表明， miRNA表达谱可以用来准确诊断肝癌和个人提供特定的治疗的预后。有些可根据miRNA的 作用，可设计治疗肝癌的miRNA的药物。
[0005] 利用miRNA作为新的生物标志物，预测肝细胞癌（HCC)的转移及治疗地预后可补 充现有诊断和治疗预后的不足。在血液中循环中的miRNA是一类新的非常有前途的疾病标 志物。患者血清中具有较高的miR-1和miR-122水平，其生存时间要比具有较低的miR-1 的血清浓度的病人长（K5berle V et al.，Eur J Cancer，49:3442_3449,2013)。血清中 miR-122的量与肝癌血清化学参数及功能非常相关。目前，文献中报道多个miRNA与肝肿 瘤的血清学的变化有着显著的关系，包括Let7, M ir-1，Mir-15b，Mir-16, Mir-17, Mir-18， Mir-21，Mir-25, miR-26a，Mir-92, Mir-130, Mir-122, Mir-146, Mir-183, Mir-199, Mir-206， Mir-215, Mir-215, Mir-221，Mir-222, Mir-223, Mir-224, Mir-375, Mir-574, Mir-885 等 (Chai S et al，Chin J.Can，32:419-426,2013)。这些miRNA有些是减低有些升高，在发表 的文章分析，不但各个文章发现的miRNA不同，由于定量方法、及miRNA的量在血清中比较 难以提纯即分离，报道的量也大不相同。虽然miRNA具有诊断癌症的价值，但由于定量方法 的限制及不同，发表的数据没有可比性，远远达不到临床诊断及治疗预后的目的，加之在肿 瘤生长过程中,miRNA的血清的量可能随作肿瘤的生长而变化，其相应的特异的miRNA的量 也产生变化这就为利用miRNA诊断癌症的发展阶段增加了更多的困难。
[0006] 现有申请号为201010220241. 9的发明专利microRNA生物标志物及其用途，公开 了一种 microRNA 生物标志物，为 miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222中的任意1个，其序列对应为SEQ ID NO :1?SEQ ID NO :7。该发明还同时公开 了上述miRNA生物标志物的用途：用于制备具有肝癌检测能力的试剂盒。该发明还同时公 开了一种具有肝癌检测能力的试剂盒，该试剂盒由反转录系统、扩增系统和引物系统组成； 引物系统包括 miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222 中的任意 1个的茎环引物和扩增引物，能用于肝癌筛查和诊断。其仅是通过单一 miRNA的CT值来判 断确诊肝癌，但其实还是存在一定诊断误差的。很显然，该发明专利申请没有考虑到个体的 miRNA表达的绝对量的差异性，即肿瘤组织大小和发展阶段的因素及其对血清中的miRNA 的表达量的影响。加之，miRNA的提取定量方法多样、不稳定、重复性差等因素，造成了不同 实验室的结果可比性较差。如将这些因素考虑在内，该申请的测定方法具有一定的局限。
【发明内容】
[0007] 为克服【背景技术】的以上问题，提高一个可靠的利用MiRNA的血清学诊断肝癌的方 法。
[0008] 研究证明，在癌症发展过程中，有些miRNA量比正常的有所降低，有些比正常的有 所高，尤其是肝癌。
[0009] 本发明利用上述特点，解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用血清 miRNA量的变化比诊断肝癌的方法，其方法如下：收集血液样本，分离miRNA，对血液中两个 或两个以上miRNA进行定量测定，通过测定结果计算两个或两个以上miRNA的比例，通过测 量多组miRNA的比例范围来确定miRNA变化的指标，作为诊断的依据。
[0010] 根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述收集血液样本、分离miRNA、对 miRNA进行定量测定、计算miRNA的比例的具体方法如下： (1) 、从医院收集分离的血液样本，分为健康组和已确诊的肝癌组，把每组分为两个亚 组，分别是健康组Al、A2,肝癌组Bl、B2 ;对每一组样本进行如下处理：抽取外周血2ml，室 温下放置1小时，在l〇〇〇g条件下离心10分钟；然后，将抽取血浆转移到1. 5ml管中，在 I6000g条件下离心20分钟以除去残留的细胞碎屑，随后将上清液转移到干净的管中，不立 即使用试管可在-80°C储存； (2) 、分离MicrosiRNA :利用Trizol试剂及MiRNeasy试剂来分别抽提总RNA和纯化 Mir-RNA ； (3) 、对組1-1?隱进行定量测定的方法采用定量1^0?; (4) 、以健康组的A1/A2的比为对照，分别计算B1/B2组Mir-RNA变化的比例，决定 Mir-RNA变化的指标，作为诊断的依据。
[0011] 根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述肝癌组B1包含的Mir-RNA为以下任 意一个或多个：Let7C，Mir-1，Mirl5b，Mir-17, Mir-18, Mir-25, Mir-26a，Mir-92, Mir-130， Mir-146, Mir-183, Mir-206, Mir-215， Mir-221， Mir-222, Mir-223, Mir-224, Mir-375， Mir-574, Mir-885 ； Mir-1 ：UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU Mir15b ：UAGCAGCACAUGGUUUACA Mir-17 ：CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG Mir-18 ：UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG Mir-25 ：AGGCGGAGACUUGGGCAAUUG Mir-26a ：CCUAUUCUUGGUUACUUGCAC Mir-92 ： AGGGACGGGACGCGGUGCAGUG Mir-130 :ACUCUUUCCCUGUUGCACUAC Mir-146 :CCUCUGAAAUUCAGUUCUUCAG Mir-183 :UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU Mir-206 ：UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG Mir-215 ：AUGACCUAUGAAUUGACAGAC Mir-221 ：AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC Mir-222 ：AGCUACAUCUGGCUACUGGGU Mir-223 ：CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU Mir-224 ：CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU Mir-375 :UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA Mir-574 ：UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU Mir-885 :UCCAUUACACUACCCUGCCUCU 所述肝癌组B2包含的Mir-RNA为以下任意一个或多个：Mir-16, Mir-21，Mir-122， Mir-122a, Mir-125a, Mir-139, Mir-150, Mir-145, Mir-199, Mir-200, Mir-214 ; Mir-16 ：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG Mir-21 ：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA Mir-122 ：AACGCCAUUAUCACACUAAAUA Mir-122a ：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG Mir-125a ：UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA Mir-139 :UCUACAGUGCACGU⑶CUCCAGU Mir-150 :UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG Mir-145 :⑶CCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU Mir-199 ：CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC Mir-200 ：CAUCUUACCGGACAGUGCUGGA Mir-214 ：UGCCUGUCUACACUUGCUGUGC 根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述肝癌组B1中选用的第一个miRNA为 Mir-222,选用的第二个肝癌组B2中的miRNA为Mir-122a。
[0012] 根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述Mir-222和Mir-122a的比例是在 1 _4之间。
[0013] 根据本发明的另一个实施例，进一步包括包括Mir-RNA提取试剂盒。
[0014] 根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述Mir-RNA盒为Mir-122盒和Mir-222 特异性定量试剂盒。
[0015] 本发明的有益效果是，本发明通过测量两个或两个以上的Mir-RNA以及它们的比 值来诊断肝癌，可有效提高诊断肝癌的准确率。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0017] 图1是Mir_122a血清下降的程度中两组数据的直接比较。
[0018] 图2是Mir-222血清升高的程度中两组数据的直接比较。
[0019] 图3是不同组病人血清中Mir-122a、Mir-222两组数据的直接比较。
[0020] 图4是同一组病人血清中Mir-122a或Mir-222两组数据的直接比较。
【具体实施方式】
[0021] 本发明的根本目的是通过测量两组或两组以上miRNA的比值来诊断肝癌，以提高 肝癌诊断的准确率。而测定每组miRNA的量则可以采用不同方法，本发明测定miRNA量方 法的实施例一如下： 步骤1 :血液样本被预先从医院采集，分为健康组和已确诊肝癌组。把每组分为两组， 分别是健康组:A1、A2,肝癌组：B1、B2,每一组样品均采用下列步骤2、3、4测定其miRNA的 量。
[0022] 步骤2:抽取每一组样品的外周血2ml，室温下放置1小时，在1000g条件下离心 10分钟。然后，抽取血液转移到1. 5ml管中，在16000g条件下离心20分钟以除去残留的细 胞碎屑。随后将上清液转移到干净的管中，不立马使用用的试管可以在-80° C储存。
[0023] 步骤3 :分离上清液中的MicrosiRNA :首先，利用Trizol抽提试剂(来自 Invitrogen公司）提供的使用说明来提上清液中的总RNA ;然后，利用MiRNeasy试剂(来自 Qiagen公司）提供的使用说明来纯化总RNA中的Mir-RNA。Trizol抽提试剂和MiRNeasy 试剂均是现成的试剂盒，可直接从上述公司采购得到。
[0024] 步骤4 :加 Ploy A到纯化过的Mir-RNA的3'末端，进行逆转录及PCR。
[0025] 下面结合进一步方法对上述步骤的产品进行分析测定。
[0026] 如要分析步骤3的产品中纯化总的Mir-RNA是核糖核酸(如siRNA、miRNA)，则使 用如下方法 (1)用Poly A聚合酶在小核酸的3'末端加上一段Poly A，方法如下： 1. 25ul稀释后的血浆或组织匀浆，然后按下列顺序分别加入： 0. 5ul 5X反应液 0.225ul 25mM MgCl2 0.lul ATP 0· 05ul Poly A 聚合酶 0·35ul 水 37度温育15分钟 其产物应为：5，UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGAAAAAAAAAAAAAA......3 ' 转录反应的原理及反应条件 (2) 将上述步骤3中3'末端加了 Poly A的小核酸，加入如下与带一引物的寡聚dT TTTTTTTTTTTTGAACCTAGCTGGCCAA，与小核酸的Poly A尾巴发生特异性结合，结合结 果如下： 5，UAGCUUAUCAGACUGA腳UGAAAAAAAAAAAAAA......3， TTTTTTTTTTTTTTGAACCTAGCTGGCCAA 加寡聚dT的方法为：在步骤3后完成的反应中加入下列试剂： 0.625ul逆转录缓冲液 (该缓冲液可从不同厂家采买，均能实现该试验效果） 1.875ul含寡聚dT的引物 65度孵育5分钟 带引物的寡聚dT与小核酸的Poly A尾巴发生特异性结合， 然后分别加入： 6. 25ul 2X反应液 1. 25ul反转录酶 50度孵育5分钟，85度孵育5分钟，合成cDNA (3) 将上述步骤中合成的cDNA稀释加入5'和3'引物：5' TCCGAATAAACTCCAGGCCTA 3' 和5'AACCGGTCGATCCAA 3'，并按下列的每管的量，用API7500荧光定量PCR仪，定量PCR扩 增来测定步骤3产品中小核酸的量。
[0027] 每管的量： 6ul 稀释的cDNA (来自上述过程（3)) 10ul 2X反应液 0. 4.l 50X SYBR green 1. 5ul PCR 引物（6uM) 2. lul 水 95度15分钟，40个循环：95度15秒，55度30秒，72度30秒。
[0028] 上面提到的Mir-RNA定量RT-PCR的特异性引物序列表。
【权利要求】
1. 一种利用血清miRNA量的变化比诊断肝癌的方法，其特征是，其方法如下：收集血液 样本，分离miRNA，对血液中两个或两个以上miRNA进行定量测定，通过测定结果计算两个 或两个以上miRNA的比例，通过测量多组miRNA的比例范围来确定miRNA变化的指标，作为 诊断的依据。
2. 根据权利要求1所述的利用血清miRNA量的变化比诊断肝癌的方法，其特征是，所述 收集血液样本、分离miRNA、对miRNA进行定量测定、计算miRNA的比例的具体方法如下： (1) 、从医院收集分离的血液样本，分为健康组和已确诊的肝癌组，把每组分为两个亚 组，分别是健康组Al、A2,肝癌组Bl、B2 ;对每一组样本进行如下处理：抽取外周血2ml，室 温下放置1小时，在lOOOg条件下离心10分钟；然后，将抽取血浆转移到1. 5ml管中，在 I6000g条件下离心20分钟以除去残留的细胞碎屑，随后将上清液转移到干净的管中，不立 即使用试管可在-80°C储存； (2) 、分离MicrosiRNA :利用Trizol试剂及MiRNeasy试剂来分别抽提总RNA和纯化 Mir-RNA ； (3) 、对組1-1?隱进行定量测定的方法采用定量1^0?; (4) 、以健康组的A1/A2的比为对照，分别计算B1/B2组Mir-RNA变化的比例，决定 Mir-RNA变化的指标，作为诊断的依据。
3. 根据权利要求2所述的利用血清miRNA量的变化比诊断肝癌的方法，其特征是， 所述肝癌组B1包含的Mir-RNA为以下任意一个或多个：Let7C，Mir-l，Mirl5b，Mir-17， Mir-18, Mir-25, Mir-26a, Mir-92,Mir-130,Mir-122,Mir-146,Mir-183,Mir-206,Mir-215, Mir-221, Mir-222, Mir-223, Mir-224, Mir-375, Mir-574, Mir-885 ； Mir-1 ：UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU Mir15b ：UAGCAGCACAUGGUUUACA Mir-17 ：CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG Mir-18 ：UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG Mir-25 ：AGGCGGAGACUUGGGCAAUUG Mir-26a ：CCUAUUCUUGGUUACUUGCAC Mir-92 ： AGGGACGGGACGCGGUGCAGUG Mir-130 :ACUCUUUCCCUGUUGCACUAC Mir-146 :CCUCUGAAAUUCAGUUCUUCAG Mir-183 :UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU Mir-206 ：UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG Mir-215 ：AUGACCUAUGAAUUGACAGAC Mir-221 ：AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC Mir-222 ：AGCUACAUCUGGCUACUGGGU Mir-223 ：CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU Mir-224 ：CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU Mir-375 :UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA Mir-574 ：UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU Mir-885 :UCCAUUACACUACCCUGCCUCU 所述肝癌组B2包含的Mir-RNA为以下任意一个或多个：Mir-16, Mir-21，Mir-122， Mir-122a, Mir-125a, Mir-139, Mir-150, Mir-145, Mir-199, Mir-200, Mir-214 ; Mir-16 ：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG Mir-21 ：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA Mir-122 ：AACGCCAUUAUCACACUAAAUA Mir-122a ：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG Mir-125a ：UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA Mir-139 :UCUACAGUGCACGU⑶CUCCAGU Mir-150 :UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG Mir-145 :⑶CCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU Mir-199 :CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC Mir-200 ：CAUCUUACCGGACAGUGCUGGA Mir-214 ：UGCCUGUCUACACUUGCUGUGC〇
4. 根据权利要求3所述的利用血清miRNA量的变化比诊断肝癌的方法，其特征是，所 述肝癌组B1中选用的第一个miRNA为Mir-222,选用的第二个为肝癌组B2中Mir-RNA为 Mir-122a〇
5. 根据权利要求4所述的利用血清miRNA量的变化比诊断肝癌的方法，其特征是，所述 Mir-222和Mir-122a的比例是在1-4之间。
6. -种用于权利要求1?5所述方法的定量试剂盒，其特征是，包括Mir-RNA提取试剂 盒。
7. -种用于权利要求6所述方法的定量试剂盒，其特征是，所述Mir-RNA盒为Mir-122 盒和Mir-222特异性定量试剂盒。
【文档编号】C12Q1/68GK104120185SQ201410375653
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年8月1日 优先权日:2014年8月1日
【发明者】崔坤元, 夏国庆 申请人:常州百代生物科技有限公司