一种以菜粕为原料液态发酵生产伊枯草菌素的方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】。一种以菜粕为原料液态发酵生产伊枯草菌素的方法，其特征在于包括如下步骤：1)菌株活化，得到活化的枯草芽孢杆菌；2)摇瓶培养；3)发酵罐培养：将摇瓶培养的枯草芽孢杆菌在发酵培养基中进行发酵，发酵条件为：接种量2-10％(v/v)，pH7.0，发酵通风比为1～2：1(vvm)，搅拌转速300-800rpm，发酵周期72小时；4)分别收集发酵上清液和菜粕残渣。本发明所采用的利用菜粕作为氮源液态发酵在获取高浓度伊枯草菌素的同时，经适当干燥处理后的菜粕残渣不仅可作为富含益生菌的饲用蛋白使用，还可作为具有抑菌功能的生物有机肥使用，从而实现菜粕资源的高值化全利用。
【专利说明】一种以菜粕为原料液态发酵生产伊枯草菌素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种以菜柏为原料液态发酵生产伊枯草菌素 的方法。
【背景技术】
[0002] 农产品加工副产物如豆柏、花生柏和玉米蛋白粉等有机氮源已被广泛应用于各种 生物产品的发酵过程中。其中，豆柏及其衍生物是许多微生物次级代谢产物（如抗生素） 工业发酵的最佳氮源。相对于豆柏，菜柏是一种更为廉价的蛋白资源，但其作为发酵原料直 接生物利用报道相对较少，早期研究主要集中在以菜柏作为基质固态发酵生产各种酶制剂 的报道上。菜柏是一种非可溶性缓释氮源，大量的菜柏蛋白被非淀粉多糖如纤维素包裹，使 得可溶性蛋白含量和游离氮的释放效率很低，一般的工业微生物难以直接利用。近年来，国 际上很多研究者利用菜柏的营养特性，将菜柏经过有效的预处理后，进行液态发酵生产有 机酸和微生物油脂等高附加值产品。预处理工艺使得大量的游离氨基酸从固态菜柏中释放 出来，不仅提高了微生物对菜柏中氮素营养的吸收利用效率，同时也扩宽了菜柏的微生物 应用范围。但是，预处理过程使菜柏利用过程中生产成本相应增加，还可能会造成菜柏中的 特定营养成分的破坏或流失。菜柏作为一种特殊形式的氮源，国内外至今还没有将其直接 利用进行液态发酵的报道。
[0003] 伊枯草菌素 A是芽孢杆菌经级代谢产生的一种具有广谱抗真菌活性的环脂肽抗 生素，其分子结构由七个氨基酸残基组成的肽链和一个β_氨基脂肪酸侧链（链长C14-C17 不等）构成，可广泛用于防治各种作物的真菌病害，具有抑菌持久、稳定性好、不易产生抗 药性和对环境安全等优点，是一种极具研究开发价值和应用前景的新型生物农药。然而，由 于其发酵生产成本高、产量低，严重制约着其工业化生产和商业化应用。为了进一步提高伊 枯草菌素的产量、降低生产成本，目前国内外大部分研究集中在菌种筛选、遗传改良、廉价 原料的使用及培养营养和环境因子的优化等方面。然而，利用未经处理的廉价菜柏作为氮 源液态发酵生产伊枯草菌素，尚未见文献报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种以菜柏为原料液态发酵生产伊枯草菌素的方法，利用本 发明能有效降低伊枯草菌素的发酵生产成本，同时扩宽了菜柏的应用范围，实现了廉价菜 柏的生物高值化利用。
[0005] 为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种以菜柏为原料液态发酵生产 伊枯草菌素的方法，其特征在于包括如下步骤：
[0006] 1)菌株活化：先将枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis3_10) (GeneBank登陆号： JF460845,由华中农业大学陈守文教授馈赠）转斜面在28°C培养箱中培养24小时，培养基 为LB琼脂培养基，得到活化的枯草芽孢杆菌；
[0007] 2)摇瓶培养：挑取活化的枯草芽孢杆菌单菌落于LB液体培养基中进行摇瓶培养 14小时，温度为28°C，转速为220rpm ;
[0008] 3)发酵罐培养：将摇瓶培养的枯草芽孢杆菌在发酵培养基中（7L发酵罐中）进行 发酵，发酵条件为：接种量2-10% (v/v)(摇瓶培养的枯草芽孢杆菌的体积为发酵罐初始发 酵培养基体积的2-10% )，pH7. 0,发酵通风比为1?2 :1 (vvm)(通风比为一分钟内通过单 位体积发酵培养基的空气体积比），搅拌转速300-800rpm，发酵72小时；
[0009] 所述发酵培养基组成：菜柏 60-90g/L，碳源 20-40g/L，Κ2ΗΡ04 · 3H201g/L， MgS04 · 7Η200· 5g/L，MnS04 · Η200· 005g/L，水 1L ;
[0010] 4)分别收集发酵上清液和菜柏残渣：发酵后的固液混合物经离心处理后，上清液 为含伊枯草菌素粗品；沉淀为发酵后的菜柏残渣，对发酵后的菜柏残渣干燥，干燥后的菜柏 残渣可作为富含益生菌的饲用蛋白使用，还可作为具有抑菌功能的生物有机肥使用；
[0011] 含伊枯草菌素粗品（上清液）经甲醇抽提后采用超高效液相色谱检查伊枯草菌素 含量，发酵后的菜柏残渣经冷冻干燥处理后，检测芥子碱和硫甙等抗营养因子含量。
[0012] 所述碳源为甘油、葡萄糖、蔗糖、糖蜜、麸皮、淀粉中的任意一种或任意二种以上按 任意配比的混合（含任意二种）。
[0013] 所述菜柏经粉碎过40-80目筛。
[0014] 本发明以廉价菜柏作为氮源，菜柏的应用未经任何预处理操作。将菜柏经粉碎过 筛（40-80目）后和其它营养成分一起混合加入到发酵罐中进行液态分批培养。整个培养体 系是一种固液混合体系，菜柏中氮素营养的释放是一种缓释过程。发酵菜柏残渣中主要抗 营养因子如硫甙、芥子碱含量明显降低，且残渣中含有大量的枯草芽孢杆菌，发酵固液混合 物经离心或板框过滤处理后，经适当干燥处理后的菜柏残渣不仅可作为富含益生菌的饲用 蛋白使用，还可作为具有抑菌功能的生物有机肥使用，从而实现菜柏资源的高值化全利用。
[0015] 采用本工艺，发酵72小时伊枯草菌素浓度高达0. 60g/L，产量明显高于以商业蛋 白胨为氮源时的发酵水平。
[0016] 本发明的有益效果是：1)以廉价的菜柏作为氮源，不仅实现了低值菜柏的高值化 利用，而且极大地降低了伊枯草菌素的生产成本；2)菜柏是直接以一定比例添加到发酵液 中，避免了各种预处理操作对菜柏特定营养成分的损失，且操作简单、更易于工业化放大； 3)发酵菜柏残渣中主要抗营养因子如硫甙、芥子碱含量明显降低，且残渣中含有大量的枯 草芽孢杆菌；4)本发明所采用的利用菜柏作为氮源液态发酵在获取高浓度伊枯草菌素的 同时，经适当干燥处理后的菜柏残渣不仅可作为富含益生菌的饲用蛋白使用，还可作为具 有抑菌功能的生物有机肥使用，从而实现菜柏资源的高值化全利用。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1 :
[0018] 一种以菜柏为原料液态发酵生产伊枯草菌素的方法，将产伊枯草菌素的芽孢杆菌 接入到以菜柏为氮源的培养基中，以4mol/L氢氧化钠溶液、4mol/L稀硫酸溶液调节发酵培 养基PH，液态发酵培养，分别收集发酵液和菜柏残渣，包括如下步骤：
[0019] 1)菌株活化：先将枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis3_10) (GeneBank登陆号： JF460845,由华中农业大学陈守文教授馈赠）转斜面在28°C培养箱中培养24小时，培养基 为LB琼脂培养基，得到活化的枯草芽孢杆菌；
[0020] 2)摇瓶培养：挑取活化的枯草芽孢杆菌单菌落于LB液体培养基中进行摇瓶培养 14小时，温度为28°C，转速为220rpm ;
[0021] 3)发酵罐培养：将摇瓶培养的枯草芽孢杆菌在发酵培养基中（7L发酵罐中）进行 发酵，发酵条件为：接种量2% (v/v)(摇瓶培养的枯草芽孢杆菌的体积为发酵罐初始发酵 培养基体积的2% )，pH7. 0,发酵通风比为2 :1 (vvm)，搅拌转速600rpm，发酵72小时；
[0022] 所述发酵培养基组成：菜柏90g/L (所述菜柏经粉碎过40-80目筛），葡萄糖20g/ L，Κ2ΗΡ04 · 3H201g/L，MgS04 · 7Η200· 5g/L，MnS04 · Η200· 005g/L，水 1L ;
[0023] 4)分别收集发酵上清液和菜柏残渣：发酵后的固液混合物经离心处理后，上清液 为含伊枯草菌素粗品；沉淀为发酵后的菜柏残渣，对发酵后的菜柏残渣干燥；
[0024] 含伊枯草菌素粗品（上清液）经甲醇抽提后采用超高效液相色谱检查伊枯草菌素 含量，伊枯草菌素产量为〇. 60g/L，生产强度为0. 0083g/L/h。发酵后的菜柏残渣经冷冻干 燥处理后，检测芥子碱和硫甙等抗营养因子含量（发酵菜柏残渣中芥子碱和硫甙的含量分 别为96. 6 μ g/g和0. 48 μ mol/g，菜柏原料中芥子碱和硫甙的含量分别为5882. 6 μ g/g和 13. 94ymol/g)，经适当干燥处理后的菜柏残渣不仅可作为富含益生菌的饲用蛋白使用，还 可作为具有抑菌功能的生物有机肥使用，从而实现菜柏资源的高值化全利用。
[0025] 实施例2 :
[0026] -种以菜柏为原料液态发酵生产伊枯草菌素的方法，将产伊枯草菌素的芽孢杆菌 接入到以菜柏为氮源的培养基中，以4mol/L氢氧化钠溶液、4mol/L稀硫酸溶液调节发酵培 养基PH，液态发酵培养，分别收集发酵液和菜柏残渣，包括如下步骤：
[0027] 1)菌株活化：先将枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis3_10) (GeneBank登陆号： JF460845,由华中农业大学陈守文教授馈赠）转斜面在28°C培养箱中培养24小时，培养基 为LB琼脂培养基，得到活化的枯草芽孢杆菌；
[0028] 2)摇瓶培养：挑取活化的枯草芽孢杆菌单菌落于LB液体培养基中进行摇瓶培养 14小时，温度为28°C，转速为220rpm ;
[0029] 3)发酵罐培养：将摇瓶培养的枯草芽孢杆菌在发酵培养基中（7L发酵罐中）进行 发酵，发酵条件为：接种量2% (v/v)(摇瓶培养的枯草芽孢杆菌的体积为发酵罐初始发酵 培养基体积的2% )，pH7. 0,发酵通风比为2 :1 (vvm)，搅拌转速600rpm，发酵72小时；
[0030] 所述发酵培养基组成：菜柏60g/L (所述菜柏经粉碎过40-80目筛），葡萄糖20g/ L，Κ2ΗΡ04 · 3H201g/L，MgS04 · 7Η200· 5g/L，MnS04 · Η200· 005g/L，水 1L ;
[0031] 4)分别收集发酵上清液和菜柏残渣：发酵后的固液混合物经离心处理后，上清液 为含伊枯草菌素粗品；沉淀为发酵后的菜柏残渣，对发酵后的菜柏残渣干燥；
[0032] 含伊枯草菌素粗品（上清液）经甲醇抽提后采用超高效液相色谱检查伊枯草菌素 含量，伊枯草菌素产量为〇. 58g/L，生产强度为0. 0080g/L/h。发酵后的菜柏残渣经冷冻干 燥处理后，检测芥子碱和硫甙等抗营养因子含量（发酵菜柏残渣中芥子碱和硫甙的含量分 别为100. 5 μ g/g和0. 52 μ mol/g，菜柏原料中芥子碱和硫甙的含量分别为5882. 6 μ g/g和 13. 94ymol/g)，经适当干燥处理后的菜柏残渣不仅可作为富含益生菌的饲用蛋白使用，还 可作为具有抑菌功能的生物有机肥使用，从而实现菜柏资源的高值化全利用。
[0033] 实施例3 :
[0034] 一种以菜柏为原料液态发酵生产伊枯草菌素的方法，包括如下步骤：
[0035] 1)菌株活化：先将枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis3_10) (GeneBank登陆号： JF460845,由华中农业大学陈守文教授馈赠）转斜面在28°C培养箱中培养24小时，培养基 为LB琼脂培养基，得到活化的枯草芽孢杆菌；
[0036] 2)摇瓶培养：挑取活化的枯草芽孢杆菌单菌落于LB液体培养基中进行摇瓶培养 14小时，温度为28°C，转速为220rpm ;
[0037] 3)发酵罐培养：将摇瓶培养的枯草芽孢杆菌在发酵培养基中（7L发酵罐中）进行 发酵，发酵条件为：接种量2% (v/v)(摇瓶培养的枯草芽孢杆菌的体积为发酵罐初始发酵 培养基体积的2% )，pH7. 0,发酵通风比为1 :1 (vvm)，搅拌转速300rpm，发酵72小时；
[0038] 所述发酵培养基组成：菜柏60g/L (所述菜柏经粉碎过40-80目筛），碳源20g/L， Κ2ΗΡ04 · 3H201g/L，MgS04 · 7Η200· 5g/L，MnS04 · Η200· 005g/L，水 1L ;
[0039] 所述碳源为甘油；
[0040] 4)分别收集发酵上清液和菜柏残渣：发酵后的固液混合物经离心处理后，上清液 为含伊枯草菌素粗品；沉淀为发酵后的菜柏残渣，对发酵后的菜柏残渣干燥；
[0041] 含伊枯草菌素粗品（上清液）经甲醇抽提后采用超高效液相色谱检查伊枯草菌素 含量，伊枯草菌素产量为〇. 52g/L，生产强度为0. 0072g/L/h。发酵后的菜柏残渣经冷冻干 燥处理后，检测芥子碱和硫甙等抗营养因子含量（发酵菜柏残渣中芥子碱和硫甙的含量分 别为103. 5 μ g/g和0. 56 μ mol/g，菜柏原料中芥子碱和硫甙的含量分别为5882. 6 μ g/g和 13. 94ymol/g)，经适当干燥处理后的菜柏残渣不仅可作为富含益生菌的饲用蛋白使用，还 可作为具有抑菌功能的生物有机肥使用，从而实现菜柏资源的高值化全利用。
[0042] 实施例4 :
[0043] 一种以菜柏为原料液态发酵生产伊枯草菌素的方法，包括如下步骤：
[0044] 1)菌株活化：先将枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis3_10) (GeneBank登陆号： JF460845,由华中农业大学陈守文教授馈赠）转斜面在28°C培养箱中培养24小时，培养基 为LB琼脂培养基，得到活化的枯草芽孢杆菌；
[0045] 2)摇瓶培养：挑取活化的枯草芽孢杆菌单菌落于LB液体培养基中进行摇瓶培养 14小时，温度为28°C，转速为220rpm ;
[0046] 3)发酵罐培养：将摇瓶培养的枯草芽孢杆菌在发酵培养基中（7L发酵罐中）进行 发酵，发酵条件为：接种量10% (v/V)(摇瓶培养的枯草芽孢杆菌的体积为发酵罐初始发酵 培养基体积的10% )，pH7. 0,发酵通风比为2 :1 (vvm)，搅拌转速800rpm，发酵72小时；
[0047] 所述发酵培养基组成：菜柏90g/L (所述菜柏经粉碎过40-80目筛），碳源40g/L， Κ2ΗΡ04 · 3H201g/L，MgS04 · 7Η200· 5g/L，MnS04 · Η200· 005g/L，水 1L ;
[0048] 所述碳源为蔗糖和糖蜜，蔗糖20g/L，糖蜜20g/L。
[0049] 4)分别收集发酵上清液和菜柏残渣：发酵后的固液混合物经离心处理后，上清液 为含伊枯草菌素粗品；沉淀为发酵后的菜柏残渣，对发酵后的菜柏残渣干燥；
[0050] 含伊枯草菌素粗品（上清液）经甲醇抽提后采用超高效液相色谱检查伊枯草菌素 含量，伊枯草菌素产量为〇. 56g/L，生产强度为0. 0078g/L/h。发酵后的菜柏残渣经冷冻干 燥处理后，检测芥子碱和硫甙等抗营养因子含量（发酵菜柏残渣中芥子碱和硫甙的含量分 别为93. 5 μ g/g和0. 45 μ mol/g，菜柏原料中芥子碱和硫甙的含量分别为5882. 6 μ g/g和 13. 94ymol/g)，经适当干燥处理后的菜柏残渣不仅可作为富含益生菌的饲用蛋白使用，还 可作为具有抑菌功能的生物有机肥使用，从而实现菜柏资源的高值化全利用。
[0051] 对照实施例：
[0052] 将产伊枯草菌素的芽孢杆菌接入到以蛋白胨为氮源的培养基中，包括如下步骤：
[0053] 1)菌株活化：先将枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis3_10) (GeneBank登陆号： JF460845,由华中农业大学陈守文教授馈赠）转斜面在28°C培养箱中培养24小时，培养基 为LB琼脂培养基，得到活化的枯草芽孢杆菌；
[0054] 2)摇瓶培养：挑取活化的枯草芽孢杆菌单菌落于LB液体培养基中进行摇瓶培养 14小时，温度为28°C，转速为220rpm ;
[0055] 3)发酵罐培养：将摇瓶培养的枯草芽孢杆菌在发酵培养基中（7L发酵罐中）进行 发酵，发酵条件为：接种量2% (v/v)(摇瓶培养的枯草芽孢杆菌的体积为发酵罐初始发酵 培养基体积的2% )，pH7. 0,发酵通风比为2 :1 (vvm)，搅拌转速600rpm，发酵周期为72小 时；
[0056] 所述发酵培养基组成：蛋白胨30g/L，葡萄糖20g/L，Κ2ΗΡ0 4 · 3H201g/L， MgS04 · 7Η200· 5g/L，MnS04 · Η200· 005g/L，水 1L ;
[0057] 4)收集发酵上清液：发酵后的固液混合物经离心处理后，上清液为含伊枯草菌素 粗品；
[0058] 含伊枯草菌素粗品（上清液）经甲醇抽提后采用超高效液相色谱检查伊枯草菌素 含量，伊枯草菌素产量为〇. 48g/L，生产强度为0. 0067g/L/h。
【权利要求】
1. 一种以菜柏为原料液态发酵生产伊枯草菌素的方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 菌株活化：先将枯草芽孢杆菌（BacilluSSubtilis3-10)转斜面在28°C培养箱中培 养24小时，培养基为LB琼脂培养基，得到活化的枯草芽孢杆菌； 2) 摇瓶培养：挑取活化的枯草芽孢杆菌单菌落于LB液体培养基中进行摇瓶培养14小 时，温度为28°C，转速为220rpm ; 3) 发酵罐培养：将摇瓶培养的枯草芽孢杆菌在发酵培养基中进行发酵，发酵条件为： 接种量2-10%卜八），？!17.0，发酵通风比为1?2 :1(心111)，搅拌转速300-800印111，发酵周期 为72小时； 所述发酵培养基组成：菜柏60-90g/L，碳源20-40g/L，Κ2ΗΡ04 · 3H201g/L， MgS04 · 7Η200· 5g/L，MnS04 · Η200· 005g/L，水 1L ; 4) 分别收集发酵上清液和菜柏残渣：发酵后的固液混合物经离心处理后，上清液为含 伊枯草菌素粗品；沉淀为发酵后的菜柏残渣，对发酵后的菜柏残渣进行干燥处理。
2. 根据权利要求1所述的一种以菜柏为原料液态发酵生产伊枯草菌素的方法，其特征 在于：所述碳源为甘油、葡萄糖、蔗糖、糖蜜、麸皮、淀粉中的任意一种或任意二种以上按任 意配比的混合。
3. 根据权利要求1所述的一种以菜柏为原料液态发酵生产伊枯草菌素的方法，其特征 在于：所述菜柏经粉碎过40-80目筛后直接作为氮源使用。
【文档编号】C12P21/04GK104140990SQ201410375480
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】黄凤洪, 金虎, 钮琰星, 李坤朋, 张欣然, 郭勉, 万楚筠, 李文林, 胡传炯 申请人:中国农业科学院油料作物研究所