一种α-酮戊二酸的生产方法
【专利摘要】一种α-酮戊二酸的生产方法，分别合成基因具体序列如SEQIDNO：1的glr基因和基因具体序列如SEQIDNO：2的daao基因，构建谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌；对所构建的菌进行培养后，收集菌体；在发酵罐中加入两种菌混合湿菌体至水中，然后加入L-谷氨酸至终浓度90-100g/L，再加入过氧化氢酶至浓度为100万-400万单位/升，最后用氢氧化钠调pH至7.5-8.2，即制备出反应体系进行反应；反应结束后，将反应体系中转化出的α-酮戊二酸进行分离纯化即生产出α-酮戊二酸；本发明成本低，转化率和产物浓度高，转化率达到84%以上，没有副产物响，更适合工业应用。
【专利说明】—种Ct-酮戊二酸的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生产α -酮戊二酸的方法，具体的说是一种酶法生产α _酮戊二酸的方法。
【背景技术】
[0002]α -酮戍二酸(a-Ketoglutaric acid)是细胞糖代谢的一种关键物质,参与了很多的细胞生化代谢途径，包括三羧酸循环、氨基酸和蛋白质代谢等。α -酮戊二酸在工业上用途广泛，可作为膳食补充剂、用于合成一些杂环化合物的组件，作为人类和动物氧化应激反应的保护剂、与其他物质配合能够提高运动员成绩和促进康复等。
[0003]α-酮戊二酸生产方法有多种，如化学合成法，微生物发酵法、酶促转化法等。化学合成法以琥珀酸和草酸二乙酯为原料经化学反应制备，由于成本过高、污染严重而被淘汰。微生物发酵法主要以诱变育种获得的荧光假单胞菌、解脂耶氏酵母等微生物以甘油、矿物油或菜籽油等原料发酵获得，该方法产量高、转化率高，是目前国外用的较多的一种方法，但该方法的缺陷在于发酵副产物较多，尤其是会有较多丙酮酸产生，而丙酮酸和α-酮戊二酸性质较为接近，给后续的分离纯化工作带来很大的困难，导致收率降低，纯化成本过高等问题。酶促转化法主要目前报道的有以L-谷氨酸为底物，利用L-谷氨酸氧化酶催化形成α-酮戊二酸，该反应结束后，体系中主要产物为α-酮戊二酸，副产物氧气和水易于除去，分离纯化工艺简单，纯化收率高。但L-谷氨酸氧化酶在常用的大肠杆菌宿主中表达困难，活性不高，提高了发酵的成本。
【发明内容】
[0004]本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种α-酮戊二酸的生产方法，利用谷氨酸消旋酶将L-谷氨酸转化为D-谷氨酸,然后利用高活性的D-氨基酸氧化酶将生成的D-谷氨酸进一步转化为α -酮戊二酸，从而有效的避免了 L-谷氨酸氧化酶发酵成本过高的难题，同时也避免了发酵法产物分离纯化困难的缺陷，有利于工业化生产。
[0005]一种α -酮戊二酸的生产方法，以L-谷氨酸为底物，经谷氨酸消旋酶催化，将L-谷氨酸转化为DL-谷氨酸混旋物；混旋物中的D-谷氨酸与反应体系中的氧气和水在D-氨基酸氧化酶催化下生成α-酮戊二酸、氨和过氧化氢；随着D-谷氨酸的被消耗，L-谷氨酸在消旋酶的作用下持续生成DL-谷氨酸，直至全部转化为D-谷氨酸，并最终形成α -酮戊二酸；反应过程中生成的α-酮戊二酸在过氧化氢存在下易发生脱羧反应生成丁二酸，因此，反应体系需加入过氧化氢酶，以便将反应生成的过氧化氢水解成水和氧气，避免α-酮戊二酸被氧化。
[0006]一种α-酮戊二酸的生产方法，其具体生产方法步骤为:
步骤一、谷氨酸消旋酶基因工程菌的构建
(I)、根据GenBank: AB003685.1所记载来自于枯草芽孢杆菌IFO 3336编码谷氨酸消旋酶的Wr基因序列，两端分别加上酶切位点和及?HI，起始密码子由TTG改为ATG后，进行全基因合成，合成的Wr基因具体序列如SEQ ID N0:1 ；
(2)、将合成的Wr基因用Ndel和BanMi双酶切，纯化备用；
(3)、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用Ndel和feMlI双酶切，与上步纯化的glr基因片段连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞；
(4)、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得glr表达载体pET24a-glr；
将表达载体pET24a-glr转入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中，获得可以诱导表达谷氨酸消旋酶的谷氨酸消旋酶基因工程菌；
步骤二、D-氨基酸氧化酶基因工程菌的构建
(1).根据GenBank:Z50019.1所记载来自于变异三角酵母CBS4095菌株中编码D-氨基酸氧化酶的基因daao序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI后，进行全基因合成，合成的daao基因具体序列如SEQ ID NO:2 ；
(2)、将合成的daao基因用MfcI和feMlI双酶切，纯化备用；
(3)、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用M/eI和feMlI双酶切，与上步纯化的i/aao片段连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞；
(4)、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得demo表达载体pET24a-daao;将表达载体pET24a-daao转入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中，获得可以诱导表达D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因工程菌；
步骤三、D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因工程菌的培养
将上述步骤一和步骤二所制备的谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌分别进行培养，培养的过程中加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌体，分别得到谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌，备用；具体培养方法为:
(1)、将上述步骤一和步骤二所制备的谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌的单菌落分别接种到LB液体培养基中，置于37°C过夜培养，分别得到谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌种子培养液；
(2)、将所培养的谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌种子培养液分别接种到TB培养基中，接种量为TB培养基体积的2% ;然后置于37°C培养5小时左右，加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度0.2mmol/L,降温至25°C继续培养20小时左右，培养结束，离心分别收集谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体，备用。
[0007]步骤四、以L-谷氨酸为原料，转化生产α-酮戊二酸
在发酵罐中加入质量比为1:1的谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌的混合湿菌体至水中，混合湿菌体的质量为水质量的3-5%，然后加入L-谷氨酸至终浓度90-100g/L，再加入过氧化氢酶至浓度为100万-400万单位/升,最后用氢氧化钠调pH至
7.5-8.2，即制备出反应体系；水浴保持反应体系在30-40°C，通气搅拌反应，即将反应体系中的L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸；采用高效液相色谱检测反应体系中α-酮戊二酸的含量；α -酮戊二酸的高效液相色谱检测条件为:色谱柱=HILIC色谱柱4.6*250*5 ;流动相:ΡΗ3.3-3.5的质量浓度为3%磷酸二氢:水=1:3 ;流速:1.0ml/min ;柱温:30°C ;波长:205。
[0008] 步骤五、α-酮戊二酸的分离纯化将反应体系中转化出的α-酮戊二酸进行分离纯化即生产出α-酮戊二酸，具体操作方法为:反应结束后，将反应液12000rpm离心1min ;取上清液，在上清液中加入其质量0.5%的活性炭，搅拌脱色30分钟，收集滤液进行减压浓缩，加入上清液质量2.5%的晶种，缓慢搅拌冷却至室温结晶4小时以上，抽滤收集晶体；抽滤得到的晶体，40°C真空干燥，得到α-酮戊二酸。
[0009]有益效果是:
1、本发明提供的α-酮戊二酸的生产方法，初始原料为L-谷氨酸，价格便宜。反应结束后，生成的氨、水、氧气易于除去，对产品的分离纯化没有干扰，水相体系中只剩下α-酮戊二酸，易于分离，有助于提高产品纯度和收率，降低分离成本。本发明的通过谷氨酸消旋酶将廉价原料L-谷氨酸转化为D-谷氨酸，利用高活性的D-氨基酸氧化酶将D-谷氨酸转化为α-酮戊二酸，避免了 L-谷氨酸氧化酶活性过低导致的转化反应慢的缺陷。
[0010]2、本发明提供的α-酮戊二酸的生产方法，所需的谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶均可通过构建大肠杆菌基因工程菌，然后通过发酵大量制备，相对易得和廉价。所述反应为“一锅煮”式，底物和所有酶同时加入开始反应，直接得到终产物α-酮戊二酸，中间无需分离提纯。工艺成本低，转化率和产物浓度高，转化率达到84%以上，并且没有副产物影响，该工艺方法适合工业应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是本发明α- 酮戊二酸的生产方法的反应原理图。
【具体实施方式】
[0012]一种α -酮戊二酸的生产方法，以L-谷氨酸为底物，经谷氨酸消旋酶催化，将L-谷氨酸转化为DL-谷氨酸混旋物；混旋物中的D-谷氨酸与反应体系中的氧气和水在D-氨基酸氧化酶催化下生成α-酮戊二酸、氨和过氧化氢；随着D-谷氨酸的被消耗，L-谷氨酸在消旋酶的作用下持续生成DL-谷氨酸，直至全部转化为D-谷氨酸，并最终形成α -酮戊二酸；反应过程中生成的α-酮戊二酸在过氧化氢存在下易发生脱羧反应生成丁二酸，因此，反应体系需加入过氧化氢酶，以便将反应生成的过氧化氢水解成水和氧气，避免α-酮戊二酸被氧化。
[0013]一种α-酮戊二酸的生产方法，其具体生产方法的步骤为:
步骤一、谷氨酸消旋酶基因工程菌的构建
(I)、根据GenBank: AB003685.1所记载来自于枯草芽孢杆菌IFO 3336编码谷氨酸消旋酶的Wr基因序列，两端分别加上酶切位点和及?HI，起始密码子由TTG改为ATG后，进行全基因合成，合成的Wr基因具体序列如SEQ ID N0:1，即:
CATat^gaacaaccaataggagtcattgattccggggttggcggtttaaccgttgcgaaggaaatcatgagacagctacctaaagaaaatattatctacgtcggggatacgaaacggtgtccttatggtccgcgccctgaagaagaggtgcttcaatatacgtgggagctgacgaattatttactcgaaaaccaccacatcaaaatgetcgtgatcgcctgtaatacagcaacagcgatcgctttggatgacatccagcgcagcgtcggcataccggtggtcggagtcatccagcctggtgcgagagcagcgataaaagtgacggataatcagcatatcggtgtcatcggcacagagaatacgattaagagcaatgcatacgaagaagcgcttttggcattaaaccctgatttgaaggttgaaaaccttgcctgcccgctgcttgtgccttttgtgg
【权利要求】
1.一种α -酮戊二酸的生产方法，其特征在于:其生产方法包括以下步骤: 步骤一、谷氨酸消旋酶基因工程菌的构建 (1)、根据GenBank:ΑΒ003685.1所记载来自于枯草芽孢杆菌IFO 3336编码谷氨酸消旋酶的Wr基因序列，两端分别加上酶切位点和及?ΗΙ，起始密码子由TTG改为ATG后，进行全基因合成，合成的Wr基因具体序列如SEQ ID Ν0:1 ； (2)、将合成的Wr基因用Ndel和BanMi双酶切，纯化备用； (3)、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用Ndel和feMlI双酶切，与上步纯化的glr基因片段连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞； (4)、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得glr表达载体pET24a-glr； 将表达载体pET24a-glr转入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中，获得可以诱导表达谷氨酸消旋酶的谷氨酸消旋酶基因工程菌； 步骤二、D-氨基酸氧化酶基因工程菌的构建 根据GenBank: Z50019.1所记载来自于变异三角酵母CBS4095菌株中编码D-氨基酸氧化酶的基因demo序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI后，进行全基因合成，合成的daao基因具体序列如SEQ ID NO:2 ； (2)、将合成的daao基因用MfcI和feMlI双酶切，纯化备用； (3)、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用M/eI和feMlI双酶切，与上步纯化的i/aao片段连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞； (4)、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得demo表达载体pET24a-daao;将表达载体pET24a-daao转入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中，获得可以诱导表达D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因工程菌； 步骤三、基因工程菌的培养 将上述步骤一和步骤二所制备的谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌分别进行培养，培养的过程中加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌体，分别得到谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌，备用； 步骤四、以L-谷氨酸为原料，转化生产α-酮戊二酸 在发酵罐中加入质量比为1:1的谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌的混合湿菌体至水中，混合湿菌体的质量为水质量的3-5%，然后加入L-谷氨酸至终浓度90-100g/L，再加入过氧化氢酶至浓度为100万-400万单位/升,最后用氢氧化钠调pH至7.5-8.2，即制备出反应体系；水浴保持反应体系在30-40°C，通气搅拌反应，即将反应体系中的L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸；检测反应体系中α-酮戊二酸的含量； 步骤五、α-酮戊二酸的分离纯化 将反应体系中转化出的α-酮戊二酸进行分离纯化即生产出α-酮戊二酸。
2.如权利要求1所述的α-酮戊二酸的生产方法，其特征在于:所述基因工程菌的培养方法为: (1)、将所制备的谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌的单菌落分别接种到LB液体培养基中，置于37°C过夜培养，分别得到谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌种子培养液； (2)、将所培养的谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌种子培养液分别接种到TB培养基中，接种量为TB培养基体积的2% ;然后置于37°C培养5小时左右，加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度0.2mmol/L,降温至25°C继续培养20小时，培养结束，离心分别收集谷氨酸消旋酶基因工程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体，备用。
3.如权利要求1所述的α-酮戊二酸的生产方法，其特征在于:反应体系中α-酮戊二酸含量利用高效液相色谱进行检测。
4.如权利要求3所述的α-酮戊二酸的生产方法，其特征在于:α -酮戊二酸的高效液相色谱检测条件为:色谱柱=HILIC色谱柱4.6*250*5 ;流动相:ΡΗ3.3~3.5的质量浓度为3% 磷酸二氢:水=1:3 ;流速:1.0ml/min ;柱温:30°C ;波长:205。
5.如权利要求1所述的α-酮戊二酸的生产方法，其特征在于:α -酮戊二酸的具体分离纯化方法为:反应结束后，将反应液12000rpm离心1min ;取上清液，在上清液中加入其质量0.5%的活性炭，搅拌脱色30分钟，收集滤液进行减压浓缩，加入上清液质量2.5%的晶种，缓慢搅拌冷却至室温结晶4小时以上，抽滤收集晶体；抽滤得到的晶体，40°C真空干燥，得到α-酮 戊二酸。
【文档编号】C12P7/50GK104131041SQ201410375432
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年8月1日 优先权日:2014年8月1日
【发明者】范文超, 丁鹏, 化春光 申请人:洛阳华荣生物技术有限公司