一种以人类复制缺陷腺病毒为载体的日本血吸虫病疫苗的构建及应用的制作方法
【专利摘要】一种以人类复制缺陷腺病毒为载体的日本血吸虫病疫苗的构建及应用，属于血吸虫病防治领域。本发明提供一种以人类复制缺陷腺病毒Ad5为载体的日本血吸虫病疫苗，它以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的293细胞为包装细胞系，携带的保护性抗原基因为优化后的日本血吸虫磷酸丙糖异构酶基因SjTPI.opt。该重组人5型腺病毒载体疫苗免疫动物后，能够在免疫动物体内稳定表达外源蛋白，诱导宿主产生较高的特异性体液及细胞免疫应答，保护力可超过50%，同时该疫苗具备制备方法简单、免疫操作简便等优点，具备良好的应用前景。
【专利说明】一种以人类复制缺陷腺病毒为载体的日本血吸虫病疫苗的构建及应用
【技术领域】
[0001]一种以人类复制缺陷腺病毒为载体的日本血吸虫病疫苗，目的在于预防日本血吸虫的感染。本发明属于血吸虫病防治领域。
【背景技术】
[0002]血吸虫病是一种严重危害人畜健康的感染性寄生虫病，流行于全球的76个国家、地区，有约6亿人受到该病的威胁，感染人口达2亿。我国是日本血吸虫病流行最为严重的国家，经过多年积极有效的防治，流行区被压缩在长江沿线的湖南、湖北、江西、安徽、江苏以及大山区的四川、云南等省份，它严重危害疫区人群及家畜的身体健康、严重影响当地社会经济发展和社会进步。
[0003]疫苗作为一种相对便宜且长效的防治措施，研制安全、有效、经济的血吸虫病疫苗，首先控制家畜感染，是当前血吸虫病防治工作中亟待解决的问题。由于血吸虫在终宿主体内不繁殖，如果一种疫苗能够诱导宿主产生50%的保护力就可有效减轻虫卵对宿主的损害、减少虫卵对环境的污染。目前国内外的研究人员已发现了多个疫苗候选分子并构建了多种日本血吸虫病疫苗，包括DNA疫苗、蛋白疫苗、多肽疫苗等，但动物实验结果显示这些疫苗的保护力均不理想，动物体内的减虫率仅为20%-30%，减虫率无法达到世界卫生组织提出的50%的要求。
[0004]腺病毒载体作为一种新型的疫苗递送途径，是一类置换了其中的病毒基因片段El区和/或Ε3区的复制缺陷非辅助病毒依赖型载体，其具有转染宿主范围广、可在增殖和非增殖细胞中感染和表达目的基因、又不整合染色体、无插入突变性且可同时表达多个基因等优点，因此在基因治疗及疫苗研究领域得到了广泛的应用并显示了很好的应用前景。而在日本血吸虫病疫苗研究领域还未见利用重组腺病毒作为疫苗递送载体的报道。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题之一是提供一种新型、有效的日本血吸虫病疫苗——重组腺病毒疫苗，该疫苗以人类5型复制缺陷腺病毒为载体，以优化后的TPI基因为目的抗原；
本发明要解决的技术问题之二是提供一种制备日本血吸虫病重组腺病毒疫苗的方
法;
本发明要解决的技术问题之三是提供一种基于疫苗的日本血吸虫病防治措施。
[0006]本发明的技术方案:一种重组人5型腺病毒载体疫苗株(Recombinant HumanAdenovirus Serotype 5),其命名为rAd-SjTP1.0pt,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号 CCTCC NO:V201328。
[0007]所述的重组人5型腺病毒载体疫苗株，该疫苗是以人类复制缺陷腺病毒为载体的日本血吸虫病疫苗，将保护性抗原基因克隆入由穿梭质粒和腺病毒骨架质粒同源重组产生的腺病毒载体，并在293细胞中包装获得重组腺病毒，该疫苗具有预防日本血吸虫感染的效果;
所述的保护性抗原基因为优化后日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶基因SjTP1.0pt ；
所述的穿梭质粒为pShuttle-CMV，腺病毒骨架质粒为pAdEasy-Ι ；
所述的腺病毒载体为E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒Ad5 ；
所述的腺病毒包装所用细胞为整合腺病毒El基因的293细胞； 所述的获得重组腺病毒为rAd-SjTP1.0pt。
[0008]所述的重组人5型腺病毒载体疫苗株在血吸虫病防治中的应用，具有预防日本血吸虫感染的效果，该重组人5型腺病毒载体疫苗免疫动物后，能够在免疫动物体内稳定表达外源蛋白，诱导宿主产生较高的特异性体液及细胞免疫应答，保护力可超过50%。
[0009]1、腺病毒的构建
(1)SjTP1.0pt基因的扩增及穿梭质粒的构建
以实验室前期构建并保存的质粒pcDNA3.1-SjTP1.0pt (见参考文献[I] Zhu Y, Lu F，DaiY, Wang X, Tang J, Zhao S， Zhang C， Zhang H, Lu S， Wang S.Synergistic enhancementof immunogenicity and protection in mice against Schistosoma japonicum with codonoptimization and electroporation delivery of SjTPI DNA vaccines.Vaccine.2010 ,28 (32): 5347-5355.)为模板，根据 SjTP1.0pt 基因序列，用软件 Primer Premier 5.0 设计一对引物，在引物的5’端分别引入1和通0 I酶切位点:
Pl: 5，-GTCGACATGAGCAGCAGCCGGAAGTTC-3，，
P2: 5 ’ -CTCGAGTCACTGCCGGGCCTTGCAGAT-3，，
以Pl和P2为上下游引物扩增出了 SjTP1.0pt的全基因序列(见上述参考文献[1])，大小为759bp，通过双酶切将该基因克隆入穿梭载体pShuttle-CMV中(购自Stratagene公司)，经酶切及PCR鉴定后获得含SjTPI基因的穿梭质粒pShuttle-CMV/SjTP1.0pt ；
(2)含SjTPI基因的穿梭质粒(pShuttle-CMV)与腺病毒骨架质粒(pAdEasy-Ι)同源重
组
鉴定好的上述穿梭质粒经PmeI线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-Ι (购自Stratagene公司)经电转化方法转化入大肠杆菌BJ5183,并发生同源重组,经100 μ g/mL卡那霉素筛选及酶切鉴定获得含SjTP1.0pt基因的重组腺病毒质粒；
(3)重组腺病毒质粒的包装
鉴定成功的上述重组腺病毒质粒，PacI线性化后，经脂质体法(转染试剂为FuGENEHD Transfection Reagent,购自Roche公司)转染293细胞(购自中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所)，重组腺病毒质粒在其内完成包装获得重组腺病毒rAd-SjTP1.0pt ；
2、重组腺病毒疫苗的制备
1)收毒:当转染的细胞出现特征病变(局部细胞变圆、脱落，成网状)或细胞状态不足以维持时，反复冻融细胞，-20°C冻存收获病毒；
2)重组腺病毒的扩增
用上述方法收获的病毒反复感染293细胞，扩增该重组病毒，当细胞出现病变效应后，收集细胞培养上清，用于重组病毒的纯化；
3)重组腺病毒的纯化
按Adeno-X? Virus Purification Kit (购自Clontech公司)的步骤纯化重组腺病毒，并测定病毒的滴度。
[0010]本发明的有益效果:
本发明首次利用腺病毒载体来构建日本血吸虫病疫苗，为血吸虫病防治提供一种新的、有效的手段。该重组疫苗采用复制缺陷的人5型腺病毒作为疫苗载体，对猪、牛等动物没有致病性，具有较高安全性。经实验证实，本发明构建的重组腺病毒疫苗免疫后，均能够在免疫动物体内稳定表达外源蛋白，诱导宿主产生较高的特异性体液及细胞免疫应答，保护力可超过50%，同时该疫苗制备方法简单、免疫操作简便，因此具备良好的应用前景。
[0011]生物材料样品保藏:一种重组人5型腺病毒载体疫苗株HumanAdenovirus Serotype 5"),其命名为rAd-SjTP1.0pt,已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址:中国武汉武汉大学。保藏编号CCTCC NO:V201328，保藏日期2013年7月10日。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1重组腺病毒疫苗构建流程图
图2含目的基因的穿梭质粒(pShuttle/CMV-SjTP1.0pt)鉴定结果图M Ukb DNA Marker ；U pShuttle/CMV-SjTP1.0pt ；2-3 pShuttle/CMV-SjTP1.0pt 经Sail和XhoI双酶切；
图3重组腺病毒质粒的大小及酶切鉴定图
A: Ml、DNA Markerl ;1_8 筛选的阳性腺病毒质粒；9、pShuttle/CMV-SjTP1.0pt ；
10、pAdEasy-l; M2、DNA Marker 2(DL15000);
B:M,DNA Marker(DL15000) ; UpShuttle/CMV-SjTP1.0pt; 2、pAdEasy_l; 3-8、重组腺病毒质粒PacI酶切；9-14重组腺病毒质粒；
图4转染重组腺病毒前、后293细胞形态图；A、转染前；B、转染后；
A正常293细胞形态图(100X) ; B转染重组腺病毒后293细胞形态图(100X);
图5目的基因表达mRNA水平检测结果图
MUkb DNA Marker; 2、阳性对照；3_5转染重组腺病毒后RT-PCR结果；6、转染腺病毒载体后RT-PCR结果
图6目的基因表达Western-blot检测结果图
M、Protein Marker ;1、阳性对照；2、转染重组腺病毒后血清识别结果；3、转染腺病毒载体后血清识别结果
图7免疫后特异性IgG抗体水平结果图 图8免疫后特异性IgG亚类结果图 图9免疫后各组小鼠脾细胞增殖结果图 图10免疫后各组小鼠细胞因子水平结果图 图11各组小鼠肝脏虫卵肉芽肿面积结果图。【具体实施方式】
[0013]1、目的基因(SjTP1.0pt)表达检测
1.1 mRNA水平检测
收集转染后出现病变的293细胞(包括重组腺病毒质粒和腺病毒载体质粒)及正常的293细胞各I瓶，反复冻融三次后取适量，按Trizol试剂(购自Abcam公司)说明书抽提总RNA 进行 RT-PCR，体系为总 RNA 4 μ L，Oligo dT I μ L，72°C，2min,冰浴 2min 后依次加入dNTP (2mM) 5 μ L,5*M-MLV Buffer 4 μ L, RT M-MLV 2 μ L, RNasin Plus Rnase InhibitorIuL补水至30yL，42°C反应Ih ;
PCR扩增:RT产物为模板，上述Pl和P2为引物进行PCR扩增，体系为:
模板 3 μ L TP1.0pt_A(50mM) I μ L TP1.0pt_S(50mM) I μ L 10*Reaction Buffer 5 μ L MgCl2(25mM) 3 μ L dNTP(2mM) 5 μ L
Taq polymerase 0.5 μ L (5U/ μ L)补充水至 50μ?。反应条件为 94°C 预变性 5min,94°C变性30s、56°C退火30s、72°C延伸30s，循环35次，72°C末端延伸7min。扩增结束后取8μ L进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，于紫外灯下观察750bp处有特异性扩增，电泳结果如图5。
[0014]1.2蛋白水平检测
采用Western-blot方法检测目的蛋白的表达，收集转染重组腺病毒、腺病毒载体及正常293细胞，按细胞总蛋白抽提试剂盒说明书抽提总蛋白，定量后取适量进行12%SDS-PAGE电泳，转膜后用rTPI免疫家兔血清识别(实验室前期制备，方法见参考文献[2]Zhu YC, He ff, Liang YS, Xu M, Yu CX, Hua WQ, Chao GQ.Development of a rapid,simple dipstick dye immunoassay for schistosomiasis diagnosis[J].J TmmunolMethods, 2002, 266(1-2): 1_5.)，所用二抗为HRP标记的羊抗兔IgG，DAB显色液(购自南京凯基生物公司)显色，结果显示目的蛋白成功表达，如图6。
[0015]2、免疫后特异性抗体水平检测
制备的含目的基因的重组腺病毒疫苗，免疫雌性BALB/c小鼠，分别采取口服、皮下及肌肉途径免疫小鼠，免疫剂量为l*108pfu/次/鼠,免疫间隔2周，于免疫前及免疫后采集小鼠血清用于抗体IgG及亚类检测。抗体检测采用间接ELISA法，包被抗原为5 μ g/mL的重组蛋白(rTPI )，血清1:100稀释，二抗分别为HRP标记的羊抗兔IgG、IgGl及IgG2a (均购自Southern Biotech公司)，TMB显色液(购自KPL公司)显色,2M硫酸终止反应后,测定OD450。
[0016]检测结果显示，该重组腺病毒疫苗经皮下和肌肉免疫后可诱导宿主产生较高特异性的IgG抗体水平，口服免疫后抗体水平较低。IgG亚类检测结果显示该重组腺病毒疫苗经肌肉免疫后IgG2a高于IgGl，而皮下免疫途径下，IgG2a低于IgGl，具体结果见图7、8。
[0017]3、免疫后脾细胞增殖水平检测
同上方法用该重组腺病毒疫苗免疫小鼠，取小鼠免疫后脾脏，无菌条件下制备单个脾细胞悬液，用细胞培养液调整细胞浓度至6*105个/mL，加入浓度为10 μ g/mL的重组蛋白(rTPI)进行刺激培养，培养条件为37 °C，5% C02，72h，并用1640完全细胞培养液(购自HyClone公司)作为空白对照,5 μ g/mL的刀豆蛋白A (ConA,购自Sigma公司)作为阳性对照。按照MTT法细胞增殖检测试剂盒(购自Invitrogen公司)说明书测定各组小鼠脾细胞增殖水平。
[0018]实验结果显示该重组腺病毒疫苗可诱导小鼠脾细胞产生特异性的增殖，各组增殖水平见图9。
[0019]4、免疫小鼠后特异性细胞因子检测
同上方法免疫小鼠，无菌条件下取各组小鼠的脾脏，制备单个脾细胞悬液，调整细胞浓度至6*106个/mL，加入浓度为10 μ g/mL的重组蛋白(rTPI)进行刺激培养，培养条件为37 °C, 5% CO2，用1640完全细胞培养液作为空白对照，刀豆蛋白A (ConAAygAiLHtSm性对照。细胞培养72h后，收集细胞培养上清，用于特异性细胞因子水平测定。细胞因子测定采用Thl/Th2/Thl7 Cytokine Kit(购自BD公司)，操作按照说明书进行。
[0020]实验结果显示，该重组 腺病毒疫苗经肌肉免疫后IL-2、IFN- Y、TNF等Thl型细胞因子水平明显升高，而皮下免疫后IL-6、IL-1O等Th2型细胞因子水平明显升高，具体结果见图10。
[0021]5、免疫保护效果的观察
雌性BALB/c 105只小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)随机分成7组，分别为空白对照组(Control),载体病毒皮下免疫组(Vector, sc),载体病毒肌肉免疫组(Vector,im)，载体病毒口服免疫组(Vector，oi)，重组腺病毒皮下免疫组(rAdV，sc)，重组腺病毒肌肉免疫组(rAdv，im)及重组腺病毒口服免疫组(rAdv，oi),免疫方法及流程同上，免疫3次，间隔2周，于末次免疫后2周，所有小鼠经腹部贴片攻击感染40条日本血吸虫尾蝴，感染后6周，剖杀小鼠，计数每只小鼠体内的成虫数，按照以下公式计算小鼠的减虫率:
减虫率=(I 一实验组成虫数/对照组成虫数)X 100%
每只小鼠摘取肝脏称重，剪碎后加入5%氢氧化钾溶液37°C消化24h，计算每克肝脏组织中的虫卵数，按以下计算减卵率:
肝脏减卵率=(I 一实验组每克肝脏虫卵数/对照组每克肝脏虫卵数)X 100%
每只小鼠的肝脏组织，进行石蜡切片HE染色后显微镜下观察每只小鼠肝脏中单个虫卵肉芽肿大小并计算其面积。
[0022]结果显示，该重组腺病毒疫苗经肌肉免疫后减虫率和肝脏减卵率可分别达到54.92%和51.62%，而经皮下免疫后保护力有所下降，减虫率和减卵率分别为37.50%和44.47%。石蜡切片观察结果显示，肌肉免疫该重组腺病毒疫苗后虫卵面积显著缩小，具体结果见图11、表1、表2。
[0023]表I各组小鼠体内成虫数及减虫率
【权利要求】
1.一种重组人 5 型腺病毒载体疫苗株Human Adenovirus Serotype5)，其命名为rAd-S jTP1.0pt，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:V201328。
2.根据权利要求1所述的重组人5型腺病毒载体疫苗株，其特征在于该疫苗是以人类复制缺陷腺病毒为载体的日本血吸虫病疫苗，将保护性抗原基因克隆入由穿梭质粒和腺病毒骨架质粒同源重组产生的腺病毒载体，并在293细胞中包装获得重组腺病毒，该疫苗具有预防日本血吸虫感染的效果； 所述的保护性抗原基因为优化后日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶基因SjTP1.0pt ； 所述的穿梭质粒为pShuttle-CMV，腺病毒骨架质粒为pAdEasy-Ι ； 所述的腺病毒载体为E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒Ad5 ； 所述的腺病毒包装所用细胞为整合腺病毒El基因的293细胞； 所述的获得重组腺病毒为rAd-SjTP1.0pt。
3.权利要求1所述的重组人5型腺病毒载体疫苗株在血吸虫病防治中的应用，其特征在于具有预防日本血吸虫感染的效果，该重组人5型腺病毒载体疫苗免疫动物后，能够在免疫动物体内稳定表达外源蛋白，诱导宿主产生较高的特异性体液及细胞免疫应答，保护力可超过50%。`
【文档编号】C12N15/861GK103451231SQ201310434267
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】戴洋, 王晓婷, 戴建荣, 邢云天, 赵松, 唐建霞, 曲国立 申请人:江苏省血吸虫病防治研究所