专利名称：一株生产微生物絮凝剂的芽孢杆菌及其在微藻采收中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物生物技术领域，特别涉及一株生产微生物絮凝剂的土壤芽孢杆菌及其在微藻采收中的应用。
背景技术：
微藻主要指体积微小的单细胞藻类，包括蓝藻、小球藻、螺旋藻等，广泛分布在淡水和海洋等不同水域，由于其细胞可合成蛋白质、脂类、多糖、色素等多种营养成分及可作为医药和化工原料的物质，在保健品、饲料、医药、化妆品、以及可再生能源生产等领域具有广泛的应用，因此引起了人们的广泛关注。微藻可固定CO2进行光合作用，降低温室效应；此夕卜，微藻可以在多种环境污水里生长，还可以利用烟道气等废气，利用微藻生产生物能源，包括生物柴油、生物乙醇及甲烷等，不仅可以补充能源供给、保障国家能源安全，还可以实现二氧化碳减排以及环境的治理，因此成为国内外研究的热点。 微藻的特征是细胞个体小，约为5到50 u m,并且光合自养培养的细胞密度很低，约为湿重15到108g/L，含水量很大，其大规模培养和生产的难点在于采收成本过高。目前微藻的采收方法主要有过滤法、气浮法、离心以及絮凝等方法。由于微藻细胞较小，过滤法不适用大规模微藻收集；气浮法虽然能达到较好的藻体与培养液分离的效果，但是耗能很高、成本较高。基于藻密度不同于培养液而采用的离心法是常用的方法，但大型离心机的设备投资和能耗都比较高。化学物质的添加可以达到较好的絮凝收集微藻的效果，而且有些已经工业化，特别是水处理方面，但是在微藻收集方面，大量添加的金属离子对环境造成二次污染，也影响产品的进一步加工和安全性。因此，开发微藻的低成本采收方法是进行微藻生物炼制和大规模工业化生产微藻能源的重要保证。微生物絮凝剂是由微生物产生的具有絮凝活性的代谢产物，与传统的无机絮凝剂和人工合成有机高分子絮凝剂相比，微生物絮凝剂具有环境友好，成本低，可生物降解等优点，利用微生物絮凝剂进行微藻的采收是有应用前途的微藻收集方法。但目前相关研究多集中在利用微生物絮凝剂进行环境污水的处理，鲜有用于微藻采收的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物絮凝剂产生菌株W3，其生产的微生物絮凝剂以及微生物絮凝剂在微藻采收中的应用。本发明涉及一株生产微生物絮凝剂的土壤芽孢杆菌(W3)菌株，分类命名为土壤芽孢杆菌Solibacillus silvestris,所述菌株的登记入册编号为CGMCC No. 5566,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2011年12月9日。该菌株筛选自大连付家庄污水处理厂活性污泥样品，有较好的耐碱性，可在培养微藻的废水里生长。在含有酵母粉10g/L，KH2P04 lg/L，MgS04 7H201g/L, pH7. 0的培养基中，37°C，200rpm条件振荡培养3天，所生产的微生物絮凝剂具有较高的微藻收集效率，海水小球藻藻细胞回收率达90%以上，而且受温度和pH的影响不大；絮凝物质稳定性好，在65°C处理半小时后仍然保持很高的絮凝能力。该菌株属于厚壁菌门，芽孢杆菌目，土壤芽孢杆菌属。菌落在LB固体培养基上37°C生长培养，开始为淡乳白色，在培养两天后为浅黄色，菌落为圆形，直径2mm左右，生长速度快。该菌株W3在pH9. 0的碱性条件下，菌株依然生长良好；在培养过海水小球藻以及淡水栅藻的培养液中仍能正常生长。菌株W3在发酵培养两天后所产生的微生物絮凝剂对微藻细胞的絮凝能力达到90%以上。本发明的有益效果是这种菌株W3所产生的微生物絮凝剂同时具有较好的pH稳定性和热稳定性，微生物絮凝剂在PH6-11的范围内对微藻维持80%以上的絮凝能力，在温度20°C -30°C内变化不大；同时，在65°C处理30min，该微生物絮凝剂对藻细胞的回收能力达90%以上，在121 °C处理20min后，其对藻细胞的回收能力维持在50%以上。该微生物絮凝剂在无金属离子添加的条件下依然能保持很高的藻细胞回收能力，避免了在微生物絮凝剂应用过程中金属离子的添加，并可降低成本，是环境友好型、经济型的微藻采收絮凝剂。
图I是不同营养成分对W3生长的影响。图中1、2 %葡萄糖，2、1 %葡萄糖，3、0 %葡萄糖，4、未添加KH2PO4, 5、未添加MgSO4 7H20，6、以海水小球藻培养废液替代去离子水，7、以淡水栅藻培养废液代替去离子水。图2是W3菌株在不同起始pH条件下的生长。图3是W3菌株生产微生物絮凝剂的时间进程。图4是W3菌株所产絮凝剂热稳定性。图中:1、20。。，2、25。。，3、30。。，4、65。。，5、121。。。图5是W3菌株所产絮凝剂pH稳定性。图6是金属离子添加对絮凝的影响。图7是W3菌株所产絮凝剂重复利用。
具体实施例方式实验材料和试剂I.菌株菌株W3由本发明人2010年从大连付家庄污水处理厂活性污泥样品中分离获得，菌种经过反复划线分离纯化，得到纯培养物。藻种海水小球藻(Chlorella vulgaris)由大连海洋大学提供并鉴定。2.生化试剂琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Solarbio公司)；测序由大连宝生物工程有限公司完成；TaKaRa rTaq (大连宝生物工程有限公司)；IOxPCR Buffer (大连宝生物工程有限公司);dNTP Mixture (大连宝生物工程有限公司)。
提取菌株基因组DNA试剂TE 缓冲液50mmol/L, pH = 8. O。Tris-HCl 缓冲液10mmol/L，pH8. O。3.培养基LB固体培养基蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母粉5g，琼脂20g，pH7. O。W3 固体培养基葡萄糖 20g，酵母粉 10g, KH2PO4 lg, MgSO4 7H20 lg，pH7. 0。絮凝剂生产培养基酵母粉10g，KH2PO4 lg, MgSO4 7H20 lg, pH7. O。f/2 海水小球藻培养液=NaNO3 75mg, NaH2PO4 H2O 5mg, Na2SiO3 9H20 20mg,Na2EDTA 4. 36mg, FeCl3 6H20 3. 16mg, CuSO4 5H20 0. Olmg, ZnSO4 7H20 0. 0 23mg,CoCl2 6H20 0. 012mg, MnCl2 4H20 0. 18mg, Na2MoO4 2H20 0. 07mg,维生素 BIO. lmg,维生素B12 0. 5mg,生物素0. 5mg,自然海水pH。说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J-萨姆布鲁克一书所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例I :本发明菌株的获得将来源于大连付家庄污水处理厂活性污泥样品经过稀释涂平板法后，将样品涂布于LB培养基平板上，37°C培养3天后，挑取单菌落用发酵培养基培养获得菌落，做絮凝试验，筛选能将微藻沉降下来的菌株。本发明菌株在LB平板上37°C下培养3天，菌落呈近似圆形，直径约为2mm，生长后期可产生浅黄色色素。在PH7-9，温度30、37°C都能正常生长，其中37°C为最适温度。该菌株于2011年12月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No. 5566。实施例2 :提取基因组DNA，以及其16SrDNA的获得提取W3基因组DNA:I.将菌株接种于LB液体培养基中，37°C下220rpm培养16小时。2.收集菌液lmL，12000rpm离心5min后去上清，向离心管中加入ImL TE缓冲液重悬菌体，充分洗漆后，12000rpm离心5min后去上清。3.重复步骤2。4.向离心管中加入ImL Tris-HCl缓冲液，然后将离心管置于_20°C冷冻15min，再煮沸lOmin，再迅速置于-20°C冷冻15min，室温放置。5.将离心管IOOOOrpm离心IOmin, 70 的乙醇洗漆一次，再10000r/min离心5min，开口挥发至无醇味，干燥后溶于30y L TE缓冲液中，制得粗DNA。16SrDNA序列的获得I6SrDNA PCR 引物如下(上游)8f: 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ’(下游)1492r :5，-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3，PCR反应条件如表I所示表IPCR反应条件
权利要求
1.一株生产微生物絮凝剂的芽孢杆菌(Solibacillus silvestris),其特征在于所述菌株的登记入册编号为CGMCC No. 5566，保藏于中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2011年12月9日。
2.根据权利要求I所述的ー株生产微生物絮凝剂的芽孢杆菌，其特征在于所述菌株产生微生物絮凝剂条件在含有酵母粉10g/L，KH2PO4 lg/L，MgSO4 · 7H201g/L, pH7. 0的培养基中，37°C，200rpm条件振荡培养3天。
3.根据权利要求2所述的ー株生产微生物絮凝剂的芽孢杆菌，其特征在于其产生的微生物絮凝剂可进行微藻的絮凝采收。
全文摘要
一株生产微生物絮凝剂的土壤芽孢杆菌W3及其在微藻采收中的应用，属于微生物生物技术领域。该菌株于2011年12月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.5566。经形态学和分子生物学鉴定，确认其为土壤芽孢杆菌Solibacillus silvestris。该菌株能在pH为9的碱性条件下正常生长，产生的微生物絮凝剂具有热稳定性和pH耐受性，对海水小球藻有较高的采收效率，最高藻细胞回收率可达90％以上，利用该菌株生产的微生物絮凝剂采收微藻作为一种新型微藻采收方法，可降低微藻生产保健品、饲料、药品及能源的生产成本。上述微生物絮凝剂在无金属离子添加的条件下依然能保持很高的藻细胞回收能力，避免了在微生物絮凝剂应用过程中金属离子的添加，并可降低成本，是环境友好型、经济型的微藻采收絮凝剂。
文档编号C12P1/04GK102676422SQ201210016040
公开日2012年9月19日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者万春, 白凤武, 赵心清 申请人:大连理工大学