专利名称：一种高危人乳头瘤病毒的pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种高危人乳头瘤病毒的 PCR检测试剂盒。
背景技术：
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的存在与多种皮肤黏膜的良、恶性增生，特别是宫颈癌的发生、发展密切相关，病毒的各型基因序列与其生物学行为存在着高度相关性。不同基因型的HPV具有不同的致病危险性。HPV DNA的检测和分型对了解相关病情、判断预后及指导治疗具有重要价值，特别是对女性生殖道肿瘤的癌情预报具有重要意义。由于缺乏体外培养系统和可靠的血清反应物，所以HPV的分类几乎完全依赖于其分子学特性。根据定义，如果Ll开放阅读框中特定的^lbp有10%不同就属于不同的HPV型。 目前世界上发现的HPV有110余种亚型，20余种HPV亚型从宫颈癌组织中分离，根据其致病力的大小分为高危型和低危型两种，国际癌症研究协会对9个国家11次病例对照研究资料分析，将昍￥6，11，40，42，43，44，54，61，70，72，81，cp6108等12种归为低危型，主要引起生殖道肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤样变(CINI)，多呈一过性，可自然逆转；高危型主要为HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56， 58，59，68，73，82等15种，主要导致CINII-III级病变和宫颈癌的发生，持续高危型HPV感染的CINI级易进展为CINII III。在全球范围内，每年约有20多万女性死于宫颈癌。在发展中国家，宫颈位置宫颈癌则属于常见多发的妇科肿瘤，排行榜首。我国每年新发现的病例为13. 15万，死亡率最高的地区是山西，最低的是西藏。当宫颈癌的症状出现三个月后就诊者已有2/3为癌症晚期。 经临床追踪观察显示，从一般的宫颈癌前病变发展为宫颈癌大约需要10年时间。从这个角度看，宫颈癌并不可怕，它是一种可预防、可治愈的疾病。防治的关键在于定期进行妇科检查，及时发现和治疗宫颈癌前病变，终止其向宫颈癌的发展。如能落实防治措施，宫颈癌的治愈率很高。宫颈癌也是目前唯一确切知道病因的癌症，这一病因就是HPV感染。因此，检测病毒，特别是高危型病毒可预示宫颈癌的发生。目前HPV感染的实验室诊断方法主要有两大类，第一类是检查HPV的感染间接证据，如醋酸白试验，细胞学及组织学检查等。由于这些方法检测的是HPV感染后对机体造成的异常变化，而HPV感染后对机体造成特定的异常变化需要一定的时间，因此这些方法只能检测出亚临床期和临床期，检测不出潜伏期，对临床的早期诊断意义不大。第二类是检查组织中是否有HPV存在，如免疫组化，超薄切片电镜技术或负染技术，以PCR为基础和HPV核酸分子检测等。由于这些方法检测的是HPV感染的直接证据，在时间上可比第一类方法能更早地检测出HPV感染，更适合早期诊断。免疫组化检测标本中是否存在HPV抗原，敏感性低，特异性高，繁琐、费时，目前已逐渐被淘汰。核酸印迹杂交的灵敏度及特异性均较高，但费时，繁杂，花费大，需用新鲜标本，实验室条件要求高，目前还未普遍用于临床。超薄切片电镜技术及负染技术可在电镜下看到典型的乳头瘤病毒颗粒，但受实验条件限制，一般的实验室很少采用。以PCR为基础和HPV核酸分子检测成为目前 HPV检测的主流方法。(1)测序分析法(kquence-based test, SBT)该方法优点是获取序列信息最多， 可以明确被测区域的多态性，并能发现新基因，是其他所有方法的参考标准。但测序法对混合感染也不易确定，特别是对于混合感染病毒比例在25%以下时，容易造成漏检，而且测序法操作繁琐，耗时费力，仪器费用高昂，难以在临床上推广使用。(2)限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP):是较早出现的HPV基因分型检测方法，利用PCR扩增具有不同酶切位点的各种 HPV基因型，将PCR产物用3-5种不同限制性内切酶进行酶切，电泳结果与已知限制性片段数据库进行比较，从而确定基因型。但该方法操作流程相对比较复杂，检测型别有限。(3)基因型特异性引物扩增法(PCR-SSP)根据不同HPV型在某一区段序列的差异，设计一系列特异性引物，不同型或亚型可扩增出不同长度的片段，并以此进行分型。该方法操作虽简单，但要保证HPV各型之间有较大差异，不但对PCR引物的设计要求较高，且每份样品需同时进行多次检测才能最终确定型别。该方法的优点是成本较低，不需要特殊设备，缺点是有时会出现较弱的扩增条带，难以判断，因而目前没有在临床或实验室广泛使用。(4)基因型特异性核酸探针杂交法(PCR-SSO)根据各型HPV某一区段的序列差异分别设计特异探针并固定在纤维素膜或玻片上，利用PCR通过生物素或荧光素标记的引物扩增HPV基因片段，产物与膜或芯片上特异性探针杂交，酶联显色反应或直接经荧光扫描仪分析，判定HPV基因型。目前在临床实验室中广泛使用的线性探针杂交(Line-Probe Assay,LiPA)就是型特异性核酸探针杂交分型方法。该方法与测序结果比较，符合率高，且在检测混合感染时，比测序法更为优越，在国内外报道的HPV基因分型研究中常用。该方法存在的不足是，对低载量病毒检测结果不太好，需要专用检测分析设备。(5)实时荧光PCR(Real time PCR)目前发展迅速，应用较广的荧光PCR技术 (Flurogenic Quantitive Polymerase Chain Reaction, FQ-PCR),根据焚光共振能量转移的原理检测HPV基因型，检测探针一般是Taqman或MGB探针，特点是方便快捷，具灵敏度高，特异性强，假阳性低，成为HPV感染诊断和辅助诊断良好方法。荧光PCR检测HPV DNA 在临床上值得推广应用。
发明内容
本发明的目的是采用实时荧光PCR技术，针对HPV 5个高危亚型基因Ll区，设计特异性引物和荧光标记探针，特异扩增和检测HPV亚型基因片段。本发明的技术方案为提供一种高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括1)特异性扩增人乳头瘤病毒的上游外引物，其碱基序列如SEQ ID NO 1所示；2)特异性扩增人乳头瘤病毒的下游外引物，其碱基序列如SEQ ID NO 2所示；3)用于检测人乳头瘤病毒的Taqman探针，其碱基序列如SEQ ID NO 3所示；4)用于检测人乳头瘤病毒的Taqman探针，其碱基序列如SEQ ID NO 4所示；5)用于检测人乳头瘤病毒的Taqman探针，其碱基序列如SEQ ID NO 5所示；
6)用于检测人乳头瘤病毒的Taqman探针，其碱基序列如SEQ ID NO 6所示；7)用于检测人乳头瘤病毒的Taqman探针，其碱基序列如SEQ ID NO 7所示；所述Taqman探针5’端用荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。优选的，所述荧光染料选自FAM、JOE和HEX，所述淬灭荧光染料选自Eclipse和 TAMRA0优选的，所述I^aqman探针5，端标记FAM，3，端标记TAMARA。优选的，所述上游引物的浓度为ΙΟμΜ，所述下游引物的浓度为ΙΟμΜ，所述 Taqman探针的浓度为10 μ Μ。优选的，所述PCR 反应试剂还包括纯水、IOXPCR buffer,25mM MgCl2,20mM dNTP、 Taq 酶、UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP、dCTP。优选的，所述试剂盒包括DNA提取液，PCR反应试剂，阳性质控品，阴性质控品。本发明的有益效果为填补了国内临床检测HPV 5个高危亚型荧光PCR试剂盒的空白。对样本的检测灵敏度达到1. OX IO3拷贝/ml，试剂盒对于HPV阴性样本，以及HPV其他亚型的样本，检测结果为阴性，无交叉反应。具有灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点。
图1为阳性参考品检测结果图；图2为阴性参考品检测结果图；图3为密度参考品的内参照结果图；图4为灵敏度参考品检测结果图。
具体实施例方式实时荧光PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。实时荧光PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。本发明试剂盒的引物为指定碱基序列的寡聚核苷酸，检测引物(HI、H2)可同时扩增HPV16、18、33、52、58亚型基因片段。由上海英骏生物技术有限公司按要求合成，PAGE纯化，核对合成报告应与合成要求(序列)一致。产品引物序列如表1所示。表 权利要求
1.一种高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应试齐IJ，所述PCR反应试剂包括1)特异性扩增人乳头瘤病毒的上游外引物，其碱基序列如SEQID NO 1所示；2)特异性扩增人乳头瘤病毒的下游外引物，其碱基序列如SEQID N0:2所示；3)用于检测人乳头瘤病毒的Taqman探针，其碱基序列如SEQID NO 3所示；4)用于检测人乳头瘤病毒的Taqman探针，其碱基序列如SEQID NO 4所示；5)用于检测人乳头瘤病毒的Taqman探针，其碱基序列如SEQID NO 5所示；6)用于检测人乳头瘤病毒的Taqman探针，其碱基序列如SEQID NO 6所示；7)用于检测人乳头瘤病毒的Taqman探针，其碱基序列如SEQID NO 7所示；所述Taqman探针5’端用荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。
2.根据权利要求1所述的高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料选自FAM、JOE和HEX，所述淬灭荧光染料选自Eclipse和TAMRA。
3.根据权利要求1所述的高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述 Taqman探针5’端标记FAM，3，端标记TAMARA。
4.按权利要求1所述的高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物的浓度为10 μ Μ,所述下游引物的浓度为10 μ Μ,所述Taqman探针的浓度为10 μ Μ。
5.按权利要求1所述的高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂还包括纯水、10 XPCR buffer,25mM MgCl2,20mM dUTP、Taq 酶、UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP、dCTP。
6.按权利要求1所述的高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括DNA提取液，阳性质控品，阴性质控品。
全文摘要
本发明的目的是采用实时荧光PCR技术，针对HPV 5个高危亚型基因L1区，设计特异性引物和荧光标记探针，特异扩增和检测HPV亚型基因片段。本发明的技术方案为提供一种高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括DNA提取液，PCR反应试剂，阳性质控品，阴性质控品。所示PCR反应试剂含有两条扩增引物和五条Taqman探针。本发明的有益效果为填补了国内临床检测HPV 5个高危亚型荧光PCR试剂盒的空白。对样本的检测灵敏度达到1.0×103拷贝/ml，试剂盒对于HPV阴性样本，以及HPV其他亚型的样本，检测结果为阴性，无交叉反应。具有灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点。
文档编号C12Q1/68GK102559932SQ201210016078
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者周晓强, 姚铭锋, 林希瑾, 秦伟, 胡守旺, 谢佐福 申请人:泰普生物科学(中国)有限公司