专利名称：拮抗HMGB1 B box的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种拮抗HMGBl B box这一重要炎症介质的单克隆抗体及其应用范围。
背景技术：
高迁移率族蛋白Bl(high mobility group protein Bi, HMGBl)为高迁移率族蛋白(HMG)家族成员之一，因在聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中具有高迁移能力而得名。 HMGBl广泛分布于淋巴组织、脑、肝、肺、心、脾、肾等组织中，HMGBl除在肝、脑组织中主要存在于胞浆外，在大多数组织中存在于胞核。HMGBl在进化过程中其氨基酸序列高度保守，啮齿类动物与人的氨基酸序列同源性高达98%以上，小鼠与大鼠氨基酸序列同源性更是高达 100%。人类HMGBl基因位于13ql2染色体上，包括5个外显子和4个内含子，编码含215个氨基酸的蛋白，由三个区域组成两个正电荷区域(A盒和B盒)，和一个负电荷羧基末端(酸性末端)。A盒(aal 79)和B盒(aa89 163)，是DNA的非特异性结合区。其中B盒前20个氨基酸是其发挥细胞因子活性的关键位点，可以诱导巨噬细胞分泌更多的致炎细胞因子如TNF-α，或树突状细胞分泌IL-6。HMGBl在胞内具有调节基因转录、稳固胞核结构的功能。胞内HMGBl可通过活化的巨噬细胞、树突状细胞主动分泌或坏死、凋亡的细胞被动释放进入胞外。释放到胞外的HMGBl通过与其配体高度聚糖化作用终产物受体(rec印tor for advanced glycation end products, RAGE)禾口 Toll 样受体(Toll like receptor, TLR)结合，一方面促进前炎症因子、趋化因子以及MHCII类分子的表达，进而参与CD4+T细胞的发育以及免疫应答的调控；另外一方面HMGBl作为晚期重要的炎症介质，参与败血症、 心血管系统疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、缺血/再灌注损伤等疾病的致病以及组织损伤与修复，中和HMGBl能够有效地的缓解以上疾病的症状，因此，HMGBl成为炎症疾病潜在的治疗靶位。而拮抗HMGBl B box的单克隆抗体能够有效地的中和HMGB1，抑制其发挥生物学效应。
发明内容
HMGBl是一重要的炎症介质广泛参与许多炎症疾病的致病，其生物学活性位点位于B box区域，中和HMGBl能够有效地缓解炎症疾病，因此制备拮抗HMGBl B box的单克隆抗体对于研究HMGBl的生物学效应、以及炎症的疾病的治疗具有重要意义。本发明提供了分泌抗HMGBl B box单克隆抗体细胞株2D4E3A2，它的保藏号是 CGMCC No. 5534。本发明所述的分泌抗HMGBl B box单克隆抗体细胞株2D4E3A2由原核表达的B box蛋白免疫BALB/c小鼠后分离脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合而制得。
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1是本发明中所用免疫原HMGBl B box蛋白的表达与纯化。M 为蛋白marker ； 空白为空载体；1 转化菌的全菌液；2 洗涤流出的液体；3 洗涤最后流出的液体；4-6 为纯化后的HMGBlB box蛋白。图2是免疫过程示意图。图3是2D4E3A2细胞系分泌的单克隆抗体亚型示意图。1，该单克隆抗体亚型；2， 亚型鉴定对照图；3，该单克隆抗体轻链类型；4，轻链类型鉴定对照图。图4是2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体用于ELISA检测示意图。图5是LPS诱导小鼠脓毒血症模型分别在4h、iai、24h心脏采血、利用2D4E3A2 细胞分泌的单克隆抗体所建立的ELISA检测血浆HMGBl。*p<0. 01。图6是利用2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体采用Western blot法检测巨噬细胞 HMGBl表达水平。图7 2D4E3A2细胞分泌的抗体能够有效地的缓解心肌炎心肌的损伤，C代表对照组E代表实验组E-B代表2D4E3A2抗体干预组。本发明的细胞株2D4E3A2于2011年11月30日提交到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为分泌抗HMGBl B box单克隆抗体细胞株，保藏编号为 CGMCC No. 5534。保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施例方式免疫原的制备HMGBl B box的蛋白采用基于工程技术由原核表达产生，HMGBl B box基因序列和对应的蛋白序列分别如下
HMGBl B box基因序列如SEQ ID NO 1所示。与基因相对应的HMGBl B box蛋白序列如SEQ ID NO 2所示。动物免疫用10 μ g纯化的B box蛋白(制备过程为将从pQE-80L(购自于第三军医大学)上切下B box基因的片段与表达载体pET-观(史小菊博士馈赠)连接，转化五coli DH5a感受态细胞。挑取单个转化菌落接种于含卡那霉素的LB培养基中，用碱裂解法小量提取质粒DNA。用Kpn I.Hind IIK大连宝生生物工程有限公司)双酶切及PCR鉴定。取阳性转化菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，于37°C振摇培养过夜。然后，取此菌液100 μ 1接种于6 ml LB培养基中(杭州天和微生物试剂有限公司)，于37°C振荡培养至0. 5<0D600<0. 6 (约 2 3 h)。加异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(isopropy-β -D-thiogalactoside，IPTG) (苏州科晴生物有限公司)至终浓度为1 mmol/L，于37°C振荡培养他后，收集菌液离心进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE)分析(PAGE 的分离胶为 150g/L)，SDS-PAGE 结果见图 1，在 Mr 约10000处有1条特别浓的蛋白带，其大小与预期的结果相当。而用IPTG诱导pET-观空载体转化菌则未见此条带。证实pETIS-HMGBl B box融合蛋白在转化菌中表达成功，见图 1中4-6位置的条带(M:为蛋白marker ；空白为空载体；1 转化菌的全菌液；2 洗涤流出的液体；3 洗涤最后流出的液体；4-6 为纯化后的HMGBlB box蛋白);以His标记的蛋白纯化柱进行纯化，纯化后与福氏完全佐剂混合并完全乳化后，经皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。隔2-3周同法进行第2次免疫，一周后，经尾静脉加强免疫(详细步骤见图2)。细胞融合及杂交瘤细胞的筛选细胞的融合按常规的方法进行，阳性细胞株的筛选采用间接ELISA进行。(详细步骤如下) 1.饲养细胞的制备
小鼠腹腔巨噬细胞的制备取6 10周龄BALB/c小鼠(扬州实验动物中心购买)，短颈处死，浸泡于75%酒精，消毒3 5分钟；用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜；用无菌注射器注 Λ 2ml左右NS,反复冲洗，吸出冲洗液；放入IOml离心管，500-800r/min离心5 6分钟， 弃尽上清；用50ml含20%小牛血清的HAT培养液制成悬液；加入M孔板，500μ 1 /孔(4 块板，50ml)；放入37°C CO2孵箱培养。2.免疫脾细胞
脾细胞悬液的制备取已经免疫的小鼠，摘眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照，同时断颈处死小鼠，浸泡于75%的乙醇5分钟，在无菌平皿中，取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中尼龙筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。骨髓瘤细胞的制备在无菌条件下取出肿瘤，剥掉外面血色部分，留取白色部分， 用不完全的培养液洗一次，置平皿中尼龙筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。3.细胞融合
(1)将上述已计数的骨髓瘤细胞与脾细胞按1 9的比例混合于50ml塑料离心管内 (一般脾细胞数较少，可以全部用完并置50ml离心管，只要将9倍于所有脾细胞量的瘤细胞加入脾细胞管即可)用不完全培养液补充至45ml，1000rpm，8分钟。(2)弃上清，(直接迅速倒尽上清，使管底朝上即可)。(3)弹击离心管底，使细胞沉淀充分混勻分散。(4)在预先调至37°C的水中进行融合即在IOOOml烧杯中加入500_600ml 40°C 的热水，并在融合前先置37°C水浴箱中预温(用温度计置烧杯的水中测定温度)。融合时
①将装有1 :9脾细胞和瘤细胞混合液的50ml离心管放入装有500ml 37°C水的烧杯中，于水面上边摇边加入Iml 50%PEG, 1分钟加完(加入PEG时逐滴加入，由慢到快，1分钟加完)。②仍在水浴中继续摇，等候1分钟(即继续摇1分钟).
③继续摇并边加边加入Iml无血清RPMI1640培养基，1分钟加完。继续遥，等1分钟后，加5ml无血清RPMI1640培养基(边加边摇，3分钟加完)。④补充无血清RPMI1640培养基至50ml刻度，800r/min离心8分钟。⑤弃上清(同上将试管底朝上弃尽液体)，轻轻打勻沉淀细胞，加入HAT培养基 96 - IOOml (即往离心管中加入50mlHAT培养基后，将离心管中的细胞悬液移至剩余45 — 50ml HAT培养基的IOOml瓶中混勻，分种于M孔培养板，每孔Iml)
⑥37°C、5% CO2孵箱培养。4.阳性细胞克隆的筛选间接ELISA法筛选细胞培养上清中分泌有抗HMGBl的抗体的细胞孔。5.杂交瘤的克隆化将阳性细胞孔进行克隆筛选出能够稳定分泌抗HMGBl B box 单克隆抗体的细胞株，命名为2D4E3A2。细胞分泌的单克隆抗体效价、反应特异性及亚型的鉴定采用间接ELISA法测定mAb的效价、Western blot法进行特异性鉴定、sigma aldrich的单克隆抗体亚型鉴定试纸条(The IsoQuick^ strips, IS0Q2Q进行单克隆抗体亚型的鉴定，其操作步骤依据说明书进行，结果见图3。由图3可以看出2D4E3A2细胞所分泌的单克隆抗体为IgGh，κ型， (1，待检单克隆抗体的亚型；2，亚型鉴定对照图；3，该单克隆抗体轻链类型；4，轻链类型鉴定对照图)。将杂交瘤细胞株稳定传代后冻存于液氮罐中，复苏后仍能有效地分泌mAb。细胞分泌的单克隆抗体的应用 2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体通过ELISA (双抗体夹心Western blot用于脊椎动物HMGBl的检测(无种属的限制);此外，2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体可用于心肌炎的治疗。应用实例如下
1. 2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体用于小鼠血浆HMGBl的检测小鼠腹腔注射LPS (10mg/kg),分别在4h、iai、24h麻醉后心脏采血，分离血浆，加入到预先包被该抗体的96孔板中，4°C培养过夜，洗涤后加入兔抗HMGBl的多克隆抗体(购自于Abcam公司)，洗涤后加入山羊抗兔的HRP-IgG抗体，洗涤后加入TMB，测其OD值(该单克隆抗体的使用方法见图4)。如图5，小鼠腹腔注射LPS24h后，血清中HMGBl水平达到 200 士67. 3ng/ml，与对照组相比明显增加。2. 2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体利用Wfestern blot法检测巨噬细胞HMGBl的表达
分离小鼠腹腔巨噬细胞种植于M孔板中，LPS刺激1小时，洗涤后换培养液，继续培养细胞，M小时后收集细胞，裂解、煮沸，进行SDS-PAGE电泳，转膜后进行免疫印迹实验，WB法检测巨噬细胞HMGBl的表达。有图6可以看出，制备的单克隆抗体(1D2F3E4、2D4E3A2)与购自于Abcam的抗体一样具有特异的反应。3. 2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体用于心肌炎的治疗
100 μ g 小鼠心肌球蛋白(MyHC- α 614_629，Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH)与福氏完全佐剂 (CFA) 1 1混合，分别在第0和7天，免疫小鼠，对照组用CFA和PBS进行免疫；在第二次免疫后一周分成两组。一组用100 μ g/mouse的HMGBl B box单克隆抗体皮下注射、另外一组用PBS，2周后处死小鼠，收集血清、福尔马林固定心脏组织；苏木精-伊红(H-E)染色。心肌损伤以及炎症细胞的浸润程度，由两位病理医生采用双盲法根据Dallas诊断标准分级进行。诊断标准如下 “0”、没有炎症浸润； “1”、心肌组织少量炎症细胞浸润； “2”、局灶性炎症细胞浸润，炎症细胞浸润数量大于100 ； “3”、大于10%的心肌断面出现心肌细胞坏死和炎症细胞的浸润； “4”、大于30%心肌断面出现心肌细胞坏死和炎症细胞的浸润。如图7注射单克隆抗体组，心肌损伤程度明显减轻。
权利要求
1.分泌抗HMGBlB box单克隆抗体细胞株2D4E3A2，它的保藏号是CGMCC No. 5534。
2.权利要求1所述的分泌抗HMGBlB box单克隆抗体细胞株2D4E3A2由原核表达的 B box蛋白免疫BALB/c小鼠后分离脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合而制得。
全文摘要
本发明涉及一种能持续稳定分泌拮抗HMGB1 B box的单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其分泌的抗体。HMGB1是一重要的炎症介质，具有促炎和趋化功能，广泛地的参与许多炎症疾病的致病，Bbox是HMGB1生物活性区域。本发明所制备的单克隆抗体具有以下特征该单克隆抗体为IgG2a,κ，能特异性的与脊椎动物HMGB1 B box结合，抑制其生物学活性；此外该单克隆抗体还可以用于westernblot、ELISA检测。总体而言，该单克隆抗体一方面可以用于脊椎动物HMGB1的检测；另外一方面还可以用于治疗。
文档编号C12N5/20GK102559604SQ201210016550
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者仝佳, 刘嫣芳, 周成林, 孙凡芝, 孙彩霞, 王胜军, 苏兆亮, 许化溪, 郑东 申请人:江苏大学