专利名称：：大白菜控制器官大小基因BrARGOS及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种大白菜的控制基因，特别是一种控制大白菜器官大小的历^P"W基因及其应用，属于分子生物学
技术领域：
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背景技术：
：优良基因的有效利用是农作物优良品种培育的物质基础和先决条件。在作物育种史上，凡是突破性的成就，都与关键基因的利用密不可分。20世纪50年代，美国大豆总产超过中国,跃居世界第一,并一直保持至今，源于他们对抗胞囊线虫基因的有效利用；60年代世界粮食的"绿色革命"，粮食产量的飞跃源于矮杆的应用；70年代中国杂交水稻轰动世界源于袁隆平先生对水稻野生不育基因的改良，90年代世界种业巨头在中国的迅猛扩张也同样源于他们长久以来对重要基因资源系统性地研究和应用。蔬菜是我们日常生活的必需品。我国政府在确保粮食安全生产的同时，也非常重视"菜篮子"工程的建设。加强国产蔬菜新品种的培育已成为广大蔬菜科技工作者的首要任务。发掘和利用与重要经济性状有关的功能基因是实现这一任务的有效途径。大白菜起源于中国，是我国的特色蔬菜。由于大白菜在我国及东亚国家的蔬菜生产和消费中占有举足轻重的地位，因此，挖掘大白菜重要功能基因并用于遗传改良显得十分重要。器官大小是大白菜的一个重要经济性状。有效利用控制大白菜器官大小的基因，在分子水平上有目的调控器官的大小和形态，可以满足市场对大白菜的不同需求。因此，控制器官大小在提高大白菜产量和质量方面具有极为重要的意义。在过去的日子里，科学家们对植物器官大小和形态发育机制进行了探索。不同物种间，植物种子和器官大小有着显著差异，但在物种内个体之间器官的大小相对一致，说明植物器官的大小是受遗传控制。植物器官的大小不但受外界环境信号的影响，而且受内部发育信号的控制。在植物体中存在着控制器官大小的基因。l.植物激素信号控制器官大小植物激素信号决定了植物器官的最终大小。一些信号调节细胞生长和细胞分裂，而其它一些信号调节有丝分裂后的细胞伸长，而细胞伸长的程度决定着器官的最终大小。拟南芥"o7(et/j^e/7e-(9Ke777r(9c/"c;!7'(9/77)禾口"r2(co/5^it""Vetrj》2ere印o/7e/)突变体分别产生过量的乙烯和组成型激活乙烯信号传导，从而导致细胞体积减小和细胞数量减少，产生的器官较小。相反，在etr7(et力j^e"erece/^ar/)禾口ei/i*(ez^j^/e/^—i/^e/^/z^VeiO突变体中，由于乙烯信号传导受到干扰，突变体的叶片和花器官比野生型的大得多。因此，乙烯调节细胞伸长的方向和程度并且影响细胞分裂，最终影响器官大小。乙烯和细胞分裂素控制细胞横向伸长，而生长素、赤霉素和油菜素内酯则控制细胞纵向伸长，这些因素都显著影响植物形态和器官大小。朋/V"说77/-5iMWW;尸，花/附)基因在细胞伸长过程中传导生长素信号。^^尸7基因异位表达使转基因烟草的叶片中产生了显著增大的细胞。然而，力5/7基因却不影响器官大小，因为细胞体积增大伴随着细胞数目的减少，最终成熟叶片的大小并没有显著的变化。拟南芥3力p7纯合突变体是胚胎致+死型。虽然在球形胚之前abpl纯合突变体发育正常，但是细胞不能伸长导致胚胎不能转变为两侧对称的结构，引起胚柄和胚囊发育不正常。在烟草细胞中反义抑制力^V基因使细胞分裂变慢，能够消除生长素诱导的细胞伸长、减少细胞分裂。这些结果表明力^7基因介导生长素诱导的细胞伸长和细胞分裂。拟南芥Ai4"基因参与了生长素信号传导，该基因在拟南芥中过量表达使植株显著增大。拟南芥^^/-3突变体的株高下降，下胚轴縮短，突变体组织中细胞大小没有明显变化而细胞数目减少。拟南芥Wc朋W突变体与a;rr7-3突变体表型相似，表现为短叶柄、短花序和巻曲且下垂的叶。生长素的极性运输也控制植物器官大小。在rera"ts(re》/j'Wer/ksw'c^st/y^W^s7(i/7"突变体中，细胞生长和持续分裂时间比野生型的长，结果产生了较大的叶片、花和较粗的茎。/^y/^I7基因对生长素的极性运输、次级苗端分生组织的形成和维管束间纤维细胞的正常分化至关重要。菠菜5bWi^7J基因在烟草中异位表达后，"5J和的水平比野生型分别下降了3倍和5倍，导致烟草的下胚轴和花序轴变短，表现出侏儒表型。油菜素内酯影响植物的生长和发育。植株矮化是油菜素内酯缺失突变体的显著表型，这类突变体的细胞长度和细胞数目显著减少，这表明油菜素内酯对植物组织伸长非常重要。拟南芥细胞色素P450CYP85A2参与合成油菜素内酯，功能缺失突变体产生较小的器官，而过量表达该基因的拟南芥产生了较大的器官。拟南芥6rasw'/7o"erwV-i/we/7^'tjVM(/^7力突变体中细胞的核内复制不能正常进行，导致细胞扩张程度下降，结果所有器官都显著减小。2.与形态建成相关的基因控制器官大小器官生长与决定器官形状的模式建成相伴随。大量研究表明器官形状和大小有关。一些发育因子既参与了器官的形态建成又参与了器官的大小控制。7W7ZM77^LTA(yW^)调节拟南芥叶片的纵向生长。ro"突变体叶片的宽度没有改变但比野生型的叶片要短，相反欣7^基因的过量表达增加了叶片和花器官的长度，而宽度没有改变。傲7^基因在器官形成过程中调节细胞的纵向生长从而决定器官长度。JM^r/尸&Z4突变体的细胞不能正常伸长，从而产生了较窄的叶片。每一种器官的形状和大小都有其特点，例如叶、花瓣和雄蕊，因此器官本身可能就是一个器官最终大小的决定因子。也就是说，一些决定器官特性的基因也决定着特定器官的大小。例如在拟南芥中VM/5Z/y^fl^6^(5"确定花器官和分生组织的特性，但也影响器官大小。"/b突变体中除了花器官的同源转换外，嵌合的花瓣和雄蕊的大小和数目也降低，而过量表达"/^基因则产生了显著增大的叶片和花瓣。V/^基因编码一个带有F-box结构域的蛋白，它调节植物激素信号的转导并且促进细胞G1/S期或G2/M期转换。MW基因可能联系了器官生长的程度和极性与细胞分裂和器官特征的决定。3.控制器官大小的基因一些基因通过协调细胞分裂和生长来决定器官大小。^re"s(er)突变体具有短的花序、果荚和果柄，表明^基因调节器官大小。^基因的同源基因^Z7和^Z2都在ERECTA信号传导途径中起作用，这三个基因协同作用共同决定了器官大小。尽管erW和eW2突变体没有明显的表型，但它们能增强ere"s突变体的表型。这些^基因功能完全缺失严重影响细胞分裂，致使较小的侧生器官产生。过量表达JtOY7和Jf6V/^的拟南芥产生较大的叶片和子叶。相反，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>三突变体产生较小的叶片和子叶，这些表型变化是由于细胞体积的增加或减小所致，表明AtGRF蛋白调节叶片和子叶组织细胞的延伸。由于在叶宽轴方向上的细胞数目减少，W77功能缺失突变体产生了较窄的叶片和花瓣，说明WF7基因控制叶片和花瓣的生长和形状。拟南芥<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>基因功能缺失突变体减小了花和叶的大小和数目，而^vr基因的异位表达增大了营养器官(如叶和茎)和花器官。^vr基因主要通过影响总细胞数目和细胞分裂程度来改变成熟器官的大小。该基因并不控制细胞生长速率和细胞周期，而是在器官形成过程中调节器官生长和细胞分裂。这些结果表明^^基因很可能维持与生长相协调的持续的细胞分裂。^T基因功能缺失致使细胞有丝分裂减少，细胞生长提前终止从而使器官减小。相反，^V7基因过量表达的植株能使自身细胞比正常细胞生长和分裂得时间更长，因而使器官增大。^Vr基因的功能并不仅限于拟南芥，35S::^Vr的表达也使转基因烟草植株增大。^^基因编码一个具有AP2-domain的转录因子，它的同源基因己经从其它植物中分离出来。油菜^4AT基因在拟南芥中异位表达也使拟南芥器官增大，这进一步支持了不同植物中Avr基因在控制器官大小方面具有保守的功能。^肝^5"基因在^V7基因的上游起作用并影响器官细胞的分裂能力。J放^基因受生长素诱导且控制器官大小。表达正义或反义^Wft基因的植株器官分别增大或减小，这是因为细胞数目和器官生长持续时间的变化而改变了器官大小。因此，如果能够找到控制大白菜器官大小的基因并加以利用，可以对大白菜品质的改良起到非常关键的作用。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种控制大白菜营养器官大小的Ar^^^基因及其应用。一种控制大白菜营养器官大小的份^^09基因，其特征在于，具有如SEQIDNo.l所示核苷酸序列，全长508个碱基，具体序列如下AAGCTGCATTGGTCAGAATGATTCGCAAAACCCCAAATTTACAAAACGACATCATAAACATCCAAGAGCGTTACTCAAACAACCTTGTCATGGACGTCGGAGGAGGAAGAAACAGCCGGAAAAACGTAAACTTTCGCCGTCCACCACCGGCAATGACGTCAGAGAACAGCAAGCATGAGTTGCGACGGACCTTCTCGTCGCAGAAAAGGTTGATGATCCCTGCGAACTACTTCAGTTTGGAGTCTTTGGTTATACTGGTCGGTCTAACGGCGTCACTGTTGATACTTCCGTTGGTTCTGCCGCCGTTACCTCCGCCTCCGTTTATGCTGCTATTGGTTCCGATTGGGATTATGGTTTTACTCATCTTTCTTGCCTTCATGCCTTCTTCCTCTTCTAGGGCCAAAGATGTAACTCCCACTTTTATGTAAATCTCTTATTATTGTATTTATAAAGTCTACGAACATTATTACACACACTAGTTCATGTTAGAACTAGAAGAAACCGTTTT。一种由上述&v^6tt基因编码的多肽，它具有如SEQIDNo.2所示氨基酸序列，全长136个氨基酸，具体序列如下MIRKTPNLQNDIINIQERYS丽LVMDVGGGRNSRKNVNFRRPPPAMTSENSKHELRRTFSSQKRLMIPANYFSLESLVILVGLTASLLILPLVLPPLPPPPFMLLLVPIGIMVLLIFLAFMPSSSSRAKDVTPTFM。一种插入了包含上述SEQIDNo.l所示核苷酸序列的载体。一种插入了包含上述SEQIDNo.1所示核苷酸序列或含有SEQIDNo.1序列载体的重组细胞。上述5rJy^0S"基因、载体或重组细胞在经济作物生产改良中的应用。有益效果本发明从大白菜中克隆了一个份，^"W基因，并证明了所述基因的功能(见图l)。实验结果表明，该基因为植物器官生长大小的控制基因，通过过量表达该基因，可以获得比野生植株产量更高的转基因作物。本发明的基因可为培育农作物新品种提供理论依据和基因资源。图1为本基因在拟南芥中过量表达后与野生型拟南芥植株的对比照片；上排为野生型植株(体积小)，下排为5r^^fl基因过量表达的转基因植株(体积大)。具体实施方式实施例基因的分离与转化以大白菜福山包头10天苗龄幼苗的地上部分为材料，取至液氮预冷的研钵中，加入液氮快速磨成粉末，将粉末装入1.5ml离心管中，迅速加入1mlTrizol(Invirogen)颠倒混匀，室温静置5分钟。在4。C，12000rpm离心IO分钟，取上清液移至新的1.5ml离心管中。加入200pl氯仿，用手剧烈摇晃15秒钟，室温静置2—3分钟。4°C，12000rpm离心15分钟。取无色水相至一新的离心管中，加入250pl异丙醇，250^1高盐溶液，颠倒混匀，室温静置10分钟。4°C，12000rpm离心10分钟，吸除上清液。加入lml冰冷的75%乙醇，蜗旋震荡。4°C，7500rpm离心5分钟。37'C干燥10分钟，加入适量的DEPC水(一般为20^1)溶解沉淀，然后置于55'C水浴中彻底溶解10分钟。迅速冰浴5分钟后稍微离心。利用TR-PCR方法扩增5MiGOS基因的编码序列。具体操作方法如下首先，将mRNA反转录成第一链cDNA，所用反转录酶为Takara公司产售的M-MLVreversetranscriptase,反应体系为25nl。依次加入1ploligodT，2pgRNA和DEPC水至13.5ial，在70。C水浴中变性5分钟，迅速冰浴5分钟，稍微离心，然后依次加入2.5|_d10mMdNTP，2.5jxl10xRT缓冲液，0.5piRecombinantRNaseinhibitor禾[l1piM-MLVreversetranscriptase。轻微混合均匀，42'C反应90分钟，85'C水浴10分钟使酶失活。为了去除RNA，加入1^RNase37'C温育30分钟，-2(TC保存。以第一链cDNA为模板扩增目的基因，所用引物为ba5:5'-TCTCGAAAGCTGCATTGGTCAGAATGATTCG-3'ba3:5'陽GTCGACAAAACGGTTTCTTCTAGTTCTAACATG-3'PCR反应体系为25pl，依次加入10xPCR缓冲液2.5|al，2pi2.5mMdNTP，2pl反转录产物2pl，正向引物(ba5)2^1，反向引物(ba3)2|al，5U/1TaqDNA聚合酶0.25pl，最后加水至25pl。PCR反应条件预变性94。C3m，变性94。C30s，退火58'C30s，延伸72。Clm，30个循环，最后延伸72。C10m，4'C保存。电泳后将PCR产物装入pGEM-Teasyvector中pGEM-Teasyvector由Promaga公司产售。将PCR产物与pGEM-Teasyvector进行连接反应，连接体系10|al，各个组分为1nlpGEM-Teasyvector,2piPCR产物，5pi2xligase缓冲液，1piligase，加水至10pl。在16'C水浴中连接12个小时，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中。将连接好的载体进行测序，确认正确无误。用Takara公司产售的^&al和5WI酶切，操作如下酶切体系40pl，包括4pll0xT缓冲液，20nl已插入片段的载体，2pl力"I，2^1和12pl水。在37'C水浴中4个小时。用杭州博日科技有限公司产售的BiospinGelExtractionKit回收基因片段，操作如下用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5ml离心管中。按1:3的比例加入ExtractionBuffer。于50。C恒温水浴中直到凝胶融化。将混合液全部转入Spincolumn内，于6000rpm离心1分钟，并弃去接液管中液体。向Spincolumn中加500ExtractionBuffer,于12000rpm离心1分钟，并弃去接液管内液体。向Spincolumn中加750piWashBuffer,于12000rpm离心1分钟，并弃去接液管内液体。再次于12000rpm离心1分钟，然后将Spincolumn转移至无菌的1.5ml离心管内。向Spincolumn中加50piElutionBuffer,并于室温放置1分钟。12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液。将回收的基因片段连接入表达载体pBI121中，操作如下连接体系10nl，包括1^pBI121载体，5pl回收的基因片段，1pi10xT4连接酶缓冲液和1plT4连接酶，在4'C下连接16小时，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5ct感受态细胞，提取质粒进行鉴定。将构建好的表达载体转入农杆菌GV3101中，操作如下取100pl农杆菌感受态细胞，加入3pl构建好的质粒DNA，冰浴5分钟，液氮冷冻l分钟，37'C水浴5分钟，然后加入lmlYEP培养基(l升YEP培养基含10g酵母提取物，10g胰蛋白胨，5g氯化钠)，28。C，200rpm振荡3个小时。10000rpm离心1分钟，弃上清液，加入100piYEP培养基重悬细胞，涂布于含50mg/ml卡那霉素，50mg/ml利福平的YEP平板上(1升YEP培养基含10g酵母提取物，10g胰蛋白胨，5g氯化钠，15g琼脂)，28。C培养2—3天。选取经转化后的农杆菌GV3101，通过浸花法转化拟南芥(Co/wm6/aeco0;;7e)。操作如下将农杆菌菌落接种于5mlYEP培养基中，28°C，200rpm振荡过夜。按1/50接种于200ml含相同抗生素的新鲜培养基中，继续培养OD6QQ为1.0，4500rpm离心5分钟收集菌体，重悬于侵染液中。转化所用的侵染液含有5%蔗糖，0.03%SilwetL-77。将拟南芥的花序浸入侵染液中30秒钟，把花盆侧放于托盘中，蒙上地膜避光24小时，第二天取下地膜，将花盆直立。制备1/2MS筛选平板(1/2MS培养基加50mg/ml卡那霉素，100mg/ml羧苄青霉素)，丁1代种子经70%乙醇消毒5分钟，2%次氯酸钠消毒10分钟后播种于筛选平板，每板播种100吗左右的拟南芥种子。4'C春化3天后放于培养箱(22°C，16小时光照/8小时黑暗)中。6天后选出绿色的生长正常的阳性植株，移入蛭石中培养，单柱收获T2代种子。繁殖并鉴定至T3代，获得纯合的转基因株系15个。基因功能的鉴定T3代纯合体株系和野生型拟南芥种子在冰箱中春化3天，消毒后将种子播于含50mg/ml卡那霉素的1/2MS培养基平板。于22'C，16小时光照/8小时黑暗培养箱中6天。待幼苗子叶完全张开后，将转基因株系和野生型幼苗移入蛭石中，然后置于培养间(22°C，16小时光照/8小时黑暗)中培养。培养30天后观察转基因株系和野生型植株的表型。结果发现转基因株系的各个器官比野生型的对应器官显著增大，具体实验数据请参见表l，说明^^iGOS基因的过量表达促进植物器官增大，从而增加生物量。表1超量表达^^G7OS与对照的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*幼苗在黑暗中生长5天.序列表SEQIDNo.1〈110〉山东省农业科学院蔬菜研究所〈120〉5r^G0基因〈160〉4<170>PatentlnVersion3.3〈210>1<211〉508〈212〉DNA〈213〉大白菜(iSrssw'carapa厶peh'/7e/757'51)〈400〉1AAGCTGCATTGGTCAGAATGATTCGCAAAACCCCAAATTTACAAAACGACATCATAAACA60TCCAAGAGCGTTACTCAAACAACCTTGTCATGGACGTCGGAGGAGGAAGAAACAGCCGGA120AAAACGTAAACTTTCGCCGTCCACCACCGGCAATGACGTCAGAGAACAGCAAGCATGAGT180TGCGACGGACCTTCTCGTCGCAGAAAAGGTTGATGATCCCTGCGAACTACTTCAGTTTGG240AGTCTTTGGTTATACTGGTCGGTCTAACGGCGTCACTGTTGATACTTCCGTTGGTTCTGC300CGCCGTTACCTCCGCCTCCGTTTATGCTGCTATTGGTTCCGATTGGGATTATGGTTTTAC360TCATCTTTCTTGCCTTCATGCCTTCTTCCTCTTCTAGGGCCAAAGATGTAACTCCCACTT420TTATGTAAATCTCTTATTATTGTATTTATAAAGTCTACGAACATTATTACACACACTAGT■TCATGTTAGAACTAGAAGAAACCGTTTT508SEQIDNo.2<210〉2〈211〉136<212〉PRT〈400>2MIRKTPNLQNDIINIQERYSNNLVMDVGGGRNSR認VNFRRPPPAMTSENSKHELRRTFS60SQKRLMIPANYFSLESLVILVGLTASLLILPLVLPPLPPPPFMLLLVPIGIMVLLIFLAF120MPSSSSRAKDVTPTFM136SEQIDNo.3〈210〉3<211〉31〈212〉DNA<400〉3TCTCGAAAGCTGCATTGGTCAGAATGATTCG31SEQIDNo.4〈210〉4〈211〉33<212〉■〈400〉4GTCGACAAAACGGTTTCTTCTAGTTCTAACATG3权利要求1、一种控制大白菜营养器官大小的BrARGOS基因，其特征在于，具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列，全长508个碱基。2、一种由上述份^^^基因编码的多肽，它具有如SEQIDNo.2所示氨基酸序列，全长136个氨基酸。3、一种插入了包含上述SEQIDNo.l所示核苷酸序列的载体。4、一种插入了包含上述SEQIDNo.1所示核苷酸序列或含有SEQIDNo.1序列载体的重组细胞。5、如权利要求l、3或4所述的份-z^O^基因、载体或重组细胞在经济作物生产改良中的应用。全文摘要本发明涉及一种大白菜的控制基因，特别是一种控制大白菜器官大小的BrARGOS基因及其应用，属于分子生物学
技术领域：
。一种控制大白菜营养器官大小的BrARGOS基因，具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列，全长508个碱基及该基因在经济作物生产改良中的应用。实验结果表明，该基因为植物器官生长大小的控制基因，通过过量表达该基因，可以获得比野生植株产量更高的转基因作物。文档编号C12N5/10GK101338316SQ200810138988公开日2009年1月7日申请日期2008年8月18日优先权日2008年8月18日发明者保王,军缪,高建伟申请人:山东省农业科学院蔬菜研究所