专利名称：一种提取和纯化聚羟基脂肪酸酯生物塑料的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取和纯化细菌体产生的可生物降解的塑料一聚羟基脂肪酸 酯(PHA)的方法。
背景技术：
PHA是一种可生物降解的，生物相容的，微生物热塑性塑料，其有可能替代由石油 衍生的热塑性塑料。PHA的分子量在50-1000kDa范围内，其聚合物的特点与聚丙烯这样的 常规的塑料相似。此外，PHA可由各种可再生资源如碳水化合物，有机酸，二氧化碳，有机废 弃物等生产。然而，当前生物合成的方法由于成本太高而受到限制。一种商业上可利用的共聚 物P(3HB-co-3HV)，当前其每公斤价格超过5美元，比每公斤价格只有1 2美元的聚丙烯 昂贵得多。对生产成本影响较大的是菌株生产PHA的效率，碳来源和下游处理程序。商业开发PHA的主要障碍是从微生物回收PHA有难度，绝大部分现已被实施的涉 及到从细胞里提取PHA的方法不仅昂贵而且不利于环境保护。所以，需要一种简单，经济， 环境友好的方法来从微生物中回收细胞内的PHA，以替代传统的方法。
发明内容
本发明描述了一种从富含PHA的细菌体内提取和纯化生物塑料聚羟基脂肪酸酯 (PHA)的方法，这种方法包括了步骤(a)提供包含富含PHA的细菌的干燥沉淀，(b)破碎干 燥沉淀，(c)用碱性溶液部分溶解步骤(b)获得的磨碎的沉淀，(d)将步骤(c)所得富含PHA 的碱性溶液勻浆化，(e)从富含PHA的碱性溶液里分离出非PHA的细胞物质(NPCM)，以及 (f)从富含PHA的碱性溶液里回收PHA颗粒。本发明由几种新的特征和这些特征的结合组成，在下文的描述中将得到完整地描 述和阐述。应当理解的是，在不脱离本发明范围或牺牲本发明任何优点的前提下，可以在细 节上作出各种变化。
具体实施例方式本发明涉及一种提取和纯化PHA的方法，在下文中，说明书将根据本发明的优选 的实施例来描述本发明。然而，应当理解的是，在说明书中限制本发明的优选实施方式仅仅 是为了方便本发明的讨论，并且，可以预见到的是，本领域技术人员可以在不脱离所附权利 要求的前提下设计出各种修改。实施例公开了从生物材料里提取和回收PHA聚合物的新的方法，其中生物材料来 自产生PHA的微生物。已经有大量报道描述了从生物里溶解或卤化提取PHA，主要是从生产PHA的微生 物里提取。最常用的化学物质是三氯甲烷，二氯甲烷或1，2_二氯乙烷。通过这种回收方法， 能够获得细胞里超过90%的聚合物。然而，由于其对于环境有害的化学性质，并且实施费用昂贵，我们发现这种方法从经济角度是不可行的，特别是在需要工业规模的处理和提取PHA 的条件下。本发明的方法既适用于从能生产PHA聚合物的天然的或通过基因工程的微生物 里回收PHA，也可以从合成的PHAs里获得。PHA是一种通用的微生物聚酯纤维，具有生物降 解性和生物兼容性。其物理性质能通过改变其共聚物的成分而改变。PHA在细菌体里以独 立的颗粒形式出现。PHAs是多种细菌累积碳和能量的储存材料。PHA化合物是羟基烃酸的 聚酯。其聚合物单体均为D(-)构型，暗示了生物合成路线的特性。根据材料的来源不同， PHA的分子量在200到3000KDa。由于其位于细胞内，提取PHA的第一步是破碎细胞壁。破碎细胞壁包括机械的和 非机械的方法。完全破碎细胞壁和释放出所有的细胞内的成分需要破坏细胞壁中提供强 度的组分，也就是革兰氏阴性细菌中的肽聚糖成分。具有最大的工业应用潜能的细胞破壁 技术是机械方法。在机械破碎期间被监测的性质包括破壁效率(通过测量释放的蛋白质的 量，酶的活性或存活的细胞数目)以及对下游处理非常重要的物理性质。不同的机械装置 破碎的细胞的性质不同(如细胞碎片的大小，微粒大小分布，粘度)，会影响到分离出目标 产物的分离技术的效率。本发明已证实通过把化学方法和机械方法结合在一起能提高PHA的回收效率。如 碱性溶液的化学处理能增加细胞的渗透性，促成部分蛋白质释放。而这可以满足部分分离 NPCM的需要，但释放像细菌包涵体和PHA这样的粒状产品需要更完全的破碎。机械破碎引 起较高的能量需求，经常导致细胞碎片微粉化(微粒尺寸减小)，从而阻碍了进一步的分 离。将利用如碱性溶液的化学物质预处理、增加单价阳离子浓度以及接下来的高压力勻浆 技术相结合，破碎力被大大增强，在减小的操作压力下被释放的最大的蛋白质接近单次跨 膜。本发明的进一步的实施例中，用不同浓度的NaOH在30°C下作用1个小时来测试回 收细胞内PHA的效率。0. lmol/L的NaOH处理后释放的蛋白质是0. 26g/g生物量，0. 5mol/ LNaOH处理后释放的蛋白质增加到0. 42g/g生物量。而且，用0. IM的NaOH处理后PHA的 纯度达到46%。进一步增加NaOH浓度到达lmol/L时，蛋白质释放量和PHA的纯度分别达 到0. 54g/g生物量和67%。因此，随着NaOH浓度的增加，蛋白质的释放量和PHA的纯度也 相应增加。另一方面，PHA的产量随着NaOH浓度升高而下降，如在0. lmol/L的NaOH下PHA 产量是0. 26g/g生物量或80%的产量，在Imol/LNaOH下PHA产量是0. 2g/g生物量或64% 的产量。实施例把含有富含PHA细胞和生长液的培养基在3500rpm离心过滤10分钟。产生的沉 淀用蒸馏水漂洗2次，从而去除多余的如乙酸和丙酸的脂肪酸。弃上清液，将湿的沉淀放在 烘箱里在60°C的温度烘干M小时，将烘干的物质用研钵和杵进行研磨以制备好细胞，以备 进一步处理或4°C储存。在30°C的温度用0. 2M的NaOH处理含有PHA的5g/L的生物60分钟，然后立刻进 行勻浆化。勻浆用定转子类的高速搅拌器固定在SOOOrpm转速进行，这个转速是节约能量 消耗的最低速度。样本的温度限制在不超过35°C，然后需要用冰或冷水冷却样品来延长勻 浆时间。最后获得的PHA用去离子水漂洗2次，在3500rpm的条件离心10分钟，然后风干。
权利要求
1.一种从富含聚羟基脂肪酸酯(PHA)细菌体内提取和纯化PHA的方法，该方法包括以 下步骤(a)提供包含富含PHA的细菌的干燥沉淀；(b)粉碎干燥沉淀；(c)用碱性溶液溶解步骤(b)得到的磨碎的沉淀；(d)将步骤(c)获得的富含PHA的碱性溶液勻浆化；(e)从富含PHA的碱性溶液中分离出非PHA细胞物质(NPCM)；以及(f)从富含PHA的碱性溶液中回收PHA颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中PHA选自由聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)，端羟 基的聚羟基丁酸酯(PHB-OH)的聚合物和共聚物组成的组。
3.根据权利要求1所述的方法，其中细菌体为能产生PHA的微生物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中干燥沉淀是由富含PHA的细菌体在离心法分离后 制成的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中干燥沉淀于大约60°C温度经过约M小时制成。
6.根据权利要求1所述的方法，其中碱性溶液为0.2mol/L的氢氧化钠(NaOH)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中利用碱性溶液处理富含PHA的溶液的处理时间为 约60分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)在SOOOrpm转速实施。
9.根据权利要求8所述的方法，其中对富含PHA的碱性溶液的勻浆化处理时间为18分钟。
10.根据权利要求1所述的方法，其中NPCM从富含PHA的碱性溶液中通过离心分离而得。
11.根据权利要求10所述的方法，其中对NPCM的离心在大约3500rpm进行两次，每次 持续约10分钟。
12.根据权利要求1所述的方法，其中PHA颗粒是从碱性溶液中通过在离心过程中用去 离子水漂洗两次回收得到。
13.根据权利要求1所述的方法，其中PHA颗粒通过烘干干燥沉淀制得。
全文摘要
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一种微生物合成的细胞内的聚合物，其在微生物内作为碳和能量的贮存材料。这种可被生物降解的材料具有和基于石油化学的热塑性塑料相似的性质。当前从细菌悬液中提取和纯化PHA是用溶解或基于卤化的方法，这些方法价格昂贵且对环境产生严重危害。本发明公开了一种用碱液和匀浆法结合处理来提取和纯化PHA的方法，该方法获得的PHA的纯度和回收率都更高。
文档编号C08G63/88GK102124045SQ200980100806
公开日2011年7月13日 申请日期2009年7月6日 优先权日2008年12月18日
发明者冯来义, 温文帝, 白井义人, 穆赫德·艾里·汉山 申请人:马来西亚博特拉大学