一种小麦抗白粉病基因Stpk-V的标记引物及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术领域，特别是一种小麦抗白粉病基因Stpk-V的标记引物及应用。
【背景技术】
[0002]小麦白粉病graminis f.sp.1riiici)是小麦生产中危害日趋严重的病害之一，20世纪80年代以后，白粉病在中国主要冬麦区逐渐从次要病害上升为主要病害，且常年发生，2004-2009年白粉病在全国平均发生面积为685万hm 2，在北部冬麦区和黄淮冬麦区，白粉病是最重要的小麦病害，在长江中下游和西南麦区，白粉病是仅次于赤霉病或条锈病的第二大病害。
[0003]目前，在小麦43个位点上发现50多个白粉病抗性基因，其中白粉病抗性基因Pm21对绝大多数白粉病生理小种表现免疫和高抗(齐莉莉等，小麦白粉病新抗源-基因Pm21.作物学报，1995，21 (3):257-262)，是小麦品种改良的重要基因资源，Chen等利用电离辐射方法获得了小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL，白粉病抗性基因被定位到6V染色体短臂上(Chen PD， Qi LLj Zhou B， Zhang SZj Liu DJ.Development and molecular cytogeneticanalysis of ^veat-HaynaIdia villosa 6VS/6AV translocat1n lines specifyingresistance to powdery mildew.Theor.Appl.Genet.，1995，91: 1125-1128)，为了进一步克隆基因，利用基因芯片技术，从簇毛麦6VS上克隆到一个与白粉病抗性相关的基因该基因是基因的一个重要候选基因(Cao A, Xing L，Wang X，Yang X,Wang Wj Sun Y，Qian C，Ni Jj Chen Y，Liu Dj Wang Xj Chen P.Serine/threoninekinase gene Stpk-V, a key member of powdery mildew resistance gene Pm21, conferspowdery mildew resistance in wheat.Proc.Natl.Acad.ScL USA, 2011，108(19):7727-7732)，利用含有基因的6VS易位系，已经育成南农9918、扬麦18等15个小麦品种，这些品种的白粉病的抗性表现为高抗-免疫(Chen PD，You CF，Hu Y，ChenSffj Zhou Bj Cao AZj Wang XE.Radiat1n-1nduced translocat1ns with reducedHaynaldi a vi llosa chromatin at the Pm21 locus for powdery mildew resistance inwheat.Molecular Breeding, 2013，31:477-484 ;张伯桥，应用滚动回交选育抗白粉病小麦新品种扬麦18，中国农学通报，2009，25 (13):74_77)。
[0004]目前，已有一些学者筛选了可用来鉴定基因的分子标记，如0PH1719。。(QiLLj Cao MS, Chen PD，Li WLj Liu DJ.1dentificat1n, mapping and applicat1n ofpolymorphic DNA associated with resistance gene Pm21 of wheat.Genome, 1996， 39:191-197)，0PH1714。。、SCAR1265.SCAR1400 (刘志勇等，小麦抗白粉病基因的分子鉴定和标记辅助选择.遗传学报，1999,26 (6):673-682 ；Liu Zj Sun Qj Yang T.Development ofSCAR markers linked to the Pm21 gene conferring resistance to powdery mildew incommon wheat.Plant breeding 1999，118，215-219)，但是在这些标记的筛选过程中，研究者只分析了含有6V染色体的材料与普通小麦之间的多态性，没有研究这些标记在涉及其他6条簇毛麦染色体材料中的扩增情况，随后研究发现，分子标记0PH1719。。和0PH1714。。在涉入簇毛麦其他染色体(6V染色体以外)的材料中也扩增出目标带，说明这两个分子标记均不是簇毛麦染色体6VS专化的标记；曹爱忠等利用探针Contigl7515设计的引物(NAU/xibaol5F和NAU/xibaol5R)进行PCR扩增，可以从普通小麦的6AS、6BS、6DS和簇毛麦的6VS上扩增出大小不同的PCR条带，从而开发出一种基于PCR饱与Pm21连锁的共显性分子标id NAU/xibaol5902 (Cao AZ, Wang XE, Chen YP, Zou Xff, Chen PD.A sequene-specificPCR marker linked with Pm21 distinguishes chromosomes 6AS， 6BS， 6DS of Triticumaestivum and 6VS of Haynaldia vi llosa.Plant Breeding, 2006，125: 201-205)，该标记在含有基因的6VS易位系中，可以扩增出902bp的特异条带，为簇毛麦染色体6VS专化的标记，但该标记在抗、感白粉病植株中分别扩增出5个和4个条带，电泳时不易区分。
[0005]InDel分子标记是通过PCR检测DNA区段内插入或缺失来寻找与目的基因连锁的检测手段，InDel广泛存在不同的植物个体内，随着部分重要农作物的全基因组测序完成和第二代测序技术的普遍使用，利用改进的生物信息学方法，可以在不同基因型中挖掘出大量的可用于发展分子标记的InDel，理论上平均每个基因附近或内部都存在一个InDel位点，这些InDel可以位于基因间区，也可以位于基因的启动子区，外显子区，内含子区和3’,5’ UTR区(张体付等,玉米功能性Insert1n/Deleti1n (InDel)分子标记的挖掘及其在杂交种纯度鉴定中的应用.玉米科学，2012,20 (2):64-68)，但将InDel应用于基因检测，目前仍未见报道。
【发明内容】
[0006]针对目前上述小麦白粉病抗性检测中存在的问题，提供一种标记引物，用于检测小麦抗白粉病基因Stpk-V，本发明是这样实现的:
一种与小麦抗白粉病基因连锁的标记引物，分子标记InDelwl9。是由核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物组成的。
[0007]本发明中，所述与小麦抗白粉病基因Stpk- V连锁的标记引物在抗小麦白粉病Stpk- K基因检测中的应用。
[0008]本发明所述的应用，是以被检测材料DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测是否含有大小为190bp的特异性条带，如存在该条带，则具有Stpk- K基因。
[0009]本发明中所述应用中，PCR扩增为:PCR反应体系为25PL:DNA模板40 ng，引物SEQID NO:1 和 SEQ ID N0:2 各 5 pmol，IXPCR buffer, 1.5 mM MgCl2,0.2 mM dNTP, Taq DNApolymerase IU ；PCR 反应循环程序为:94°C预变性 3min，94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸30s, 35个循环；72°C延伸1min ;所述电泳检测检测是指:1% Metaphor agarose胶电泳后检测，电泳电压100v，电泳时间2h。
[0010]本发明是通过对全基因序列以及普通小麦品种中国春部分测序序列进行分析，发现在K基因序列的2572bp处，中国春同源序列存在一个9bp的小片段InDel插入，在该InDel侧翼序列上设计了一对标记引物InDelwl9。，通过PCR扩增和凝胶电泳区分
和小麦同源序列位点，含有普通小麦位点只能扩增出199bp条带，而含有基因的小麦能扩增出190bp和199bp两个条带，故该标记引物因的专化分子标记引物。
[0011]本发明所述的InDel标记引物，其扩增产物就是基因本身序列，可直接对该基因进行标记辅助筛选，该标记引物对普通小麦或普通小麦-簇毛麦6VS易位系进行PCR扩增，其产物只有I个(190bp)条带或2个(190bp和199bp)条带，易于区分抗白粉病植株和感白粉病植株；并且通过InDel位点发展的分子标记具有稳定性好，共显性和容易被检测的优点，可被用于大规模的分子标记辅助选择育种中。
【附图说明】
[0012]图1为实施例1中InDelwl90标记PCR扩增产物电泳图谱；
图2为实施例1中NAU/xibaol59Q2标记PCR扩增产物电泳图谱；
图3为实施例2中标记引物InDelwl90在普通小麦-簇毛麦6V异染色体系中PCR扩增产物电泳图谱；
图4为实施例3中InDelwl90标记在宁麦9号与YC72-2杂交F2代植株中PCR扩增产物电泳图谱。
【具体实施方式】
[0013]实施例涉及的标记引物InDelwl90:
上游引物 SEQ ID NO:1 5’ - ACACGGGTTGCAGGAACATTG-3’ ；
下游引物 SEQ ID N0:2:5’ -AGCTTCTGAAGGCACACAGTAC-3’。
[0014]实施例涉及小麦来源:
普通小麦中国春，感白粉病(刘登才等，小麦中国春遗传背景的育种改良.中国农业科学，2003，36 (11):1383-1389 ;Chen PD, You CF, Hu Y, Chen Sff, Zhou B, Cao AZ, WangXE.Radiat1n-1nduced translocat1ns with reduced