专利名称：小麦抗白粉病(相关)基因克隆的制作方法
技术领域：
小麦抗白粉病(相关)基因克隆，属于生物工程领域。
背景技术：
普通小麦是异源六倍体(AABBDD)，基因组庞大(1. 6X 101Qbp)且含大量的重复序 列(约为总量的80%) (Flavell等，1974)，使得图位克隆法和筛选基因组文库法很难应用； 而由于小麦本身不含有转座子，转座子标签法也很难奏效；PCR法克隆与常规方法相比具 有快速而廉价的特点，但PCR扩增有时会引入突变，而且由于PCR法需要根据已知的资料设 计引物，创新性不高。可见，仅用某一种方法克隆小麦抗白粉病基因全长序列困难较大。这 也是目前小麦抗白粉病基因克隆进展较缓慢的主要原因。 研究表明，植物中参与抗性反应的基因可以分为抗病基因和防卫反应基 因。在抗白粉病的防御体系中，除抗白粉病基因以外，防卫反应基因如病程相关基因 (pathogenesis-relatedgene)等对于抵御白粉病的侵害都有一定的作用，因此，由于研究 策略或实验技术方面的原因，相关克隆存在克隆抗白粉病病程相关基因和抗白粉病(候 选)基因两个方面。
发明内容
病程相关基因的编码产物——病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins, 简称PRP或PRs)最早于由Van Loon和Van Kammen于1970年在烟草花叶病毒(TMV)诱发 产生过敏性反应的烟草叶片中检测到，由PR基因编码，且只有在病理或病理相关环境下才 被诱导产生。植物系统中的PRP主要有1)几丁质酶，其功能之一是裂解几丁质。研究表 明，许多危害植物的病原真菌的细胞壁主要成分是几丁质；2) P-l，3-葡聚糖酶，其功能之 一是水解P-l，3-葡聚糖多聚体，已证实P-l，3-葡聚糖酶与几丁质酶一道具有较强的抗 真菌的活性，且两种酶具有很强的协同作用。3)P-l，3-l，4-葡聚糖酶；4)脱乙酰壳多糖 酶；5)过氧化物酶；6)类甜味蛋白；7) a -淀粉酶；8)溶菌酶。PRP的作用底物为葡聚糖和 甲壳素(chitosan，又名壳聚糖，是几丁质、几丁聚糖的通称)，高等植物中不含甲壳素，只 含有少量的葡聚糖，但它们是除卵菌纲以外的绝大多数真菌细胞壁的主要碳水化合物。
现在认为，PRP参与了植物的诱导抗病性，特别是几丁质酶和13 -1，3_葡聚糖酶是 植物潜在的抗病物质。因此，PR基因的克隆受到广泛的重视。Schweizer等(1989)用大麦 白粉菌(Egh)接种小麦幼苗，通过构建cDNA文库和差异筛选分离得到6种不同诱导表达的 植物mRNA的cDNA克隆，这些基因在接种小麦白粉菌(Egt)和大麦白粉菌(Egh)后3小时被 迅速诱导。其中一个克隆(WIR3)的部分多肽序列推导分析表明其mRNA编码一种过氧化物 酶。2004年，孔凡晶等利用差异显示分析(different display analysis)技术，获得编码 产物类似几丁质酶的cDNA片段。在小麦中克隆到的与抗白粉病相关的蛋白还有类甜蛋白 (Rebmann， 1991 ;Yu Ling等，2003)、谷胱苷月太_S转移酶(Dudler， 1991)。普通小麦在水杨 酸(SA)、2，6-二氯异烟酸(INA)和苯并噻二唑类(BTH)物质诱导下，可产生一组与抗白粉病有关的富含硫元素的病程相关蛋白(Buschges，1997)，Niu Ji-shan等(2002)用mRNA差 异显示和RACE技术相结合也筛选出一个与抗病防卫反应有关的硫代硫酸硫转移酶基因。
此外，HtATP酶与细胞抗性的产生直接相关(Jaffe et al. ， 1981)。研究发 现，当植物受到化学物质、物理因素及病原菌作用后，H+-ATP酶基因表达及活性迅速提高 (Serrano, 1989) 。Yu Ling(2002)用根据抗病基因保守结构域设计的简并引物，通过RT-PCR 筛选获得一段与『41 酶高度同源的(^脆片段。顾小伟(2003)以Pm4a近等基因系 Yumai/8*Cc和Chancelor (Cc)为材料用RT-PCR和RACE技术获得一个H+-ATP酶全长cDNA 序列(Thai)，这是第一个被克隆的小麦跨膜质子泵类似基因。
权利要求
Srichumpa等(2005)利用与Pm3b紧密连锁的分子标记对含有Pm3位点10个等位基因的10个品系进行了单元型分析，发现所有品系都有一个由与Pm3b共分离的标记界定的基因组保守区域，该区域包含一个结构上与Pm3b相似的基因。然后以含有Pm3a、Pm3d和Pm3f的品系为材料进行PCR为基础的同源克隆，得到三个类似Pm3b的序列。通过瞬间转化(transient transformation)分析发现，所得到的Pm3a、Pm3d和Pm3f的候选基因均能提供分别由AvrPm3a-、AvrPm3d-和AvrPm3f-3个基因产物诱导的抗性，在氨基酸水平上，Pm3a、Pm3b、Pm3d和Pm3f编码产物有高达97.8％的相似性，在coiled-coil结构域内4种蛋白质氨基酸序列100％保守，但在NBS区内存在序列交换，表明在等位基因之间存在基因内重组(intragenicrecombination)或基因转换(gene conversion)，这些证据说明所克隆的3个候选基因是真正的抗白粉病基因，且Pm3a、Pm3b、Pm3d和Pm3f4个基因是等位基因。
全文摘要
植物中参与抗性反应的基因可以分为抗病基因和防卫反应基因。在抗白粉病的防御体系中，除抗白粉病基因以外，防卫反应基因如病程相关基因(pathogenesis-related gene)等对于抵御白粉病的侵害都有一定的作用，因此，由于研究策略或实验技术方面的原因，相关克隆存在克隆抗白粉病病程相关基因和抗白粉病(候选)基因两个方面。
文档编号C12N15/29GK101760461SQ200810238570
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月19日 优先权日2008年12月19日
发明者李祥 申请人:李祥